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日本血吸虫钙依赖热稳定蛋白（sjCRHSP-24）基因功能研究

作　者: 邹翔
导　师: 许小琴；金亚美
学　校: 扬州大学
专　业: 临床兽医
关键词: 日本血吸虫 sjCRHSP-24 RNAi 免疫保护 免疫定位
分类号: S852.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


血吸虫病(schistosomiasis)是由血吸虫(schistosome)感染引起的一种分布广泛、危害严重的人畜共患寄生虫病。血吸虫为吸虫中罕见的雌雄异体,雌雄合抱在其生长和发育方面起着非常重要的作用,生长和发育的成熟又是血吸虫雌虫产卵致病不可缺少的前提[1,2],而抱雌沟蛋白(GCP)为合抱传递的重要蛋白。因此,关于GCP的作用机理及与GCP有关的信号通路引起人们的热切关注。SjCRHSP-24为本实验室筛选的与GCP相互作用的蛋白。据报道,该蛋白为的日本血吸虫钙依赖的热稳定蛋白,与CG9705-PA类似,其在NCBI网的蛋白注册号为AAW27166。SjCRHSP-24基因全长553bp,表达产物117个氨基酸,分子量为13109Da,包含CSD结构,但其功能未见报道。鉴于这种情况,本试验对该基因功能进行了一系列研究,包括该基因的克隆表达、在不同期别虫体的表达时相、RNA干扰研究、免疫学研究及血吸虫体内该蛋白的荧光免疫定位分析。1.在酵母双杂交体系筛选出阳性克隆(sjCRHSP-24)基础上,根据NCBI网报道的完整基因序列,设计引物,经PCR扩增出带有BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点的目的片段,酶切后连接到pET-28b载体构建重组质粒,再转入BL21感受态中诱导表达。首次构建了原核表达质粒,成功地实现其在大肠杆菌中的大量表达和表达产物的免疫原性分析。以原核表达产物为免疫原制备了抗SjCRHSP-24蛋白的多抗,通过免疫荧光组织化学方法定位SjCRHSP-24蛋白在血吸虫体内的表达部位。结果表明,该蛋白在虫体内呈均匀分布,且在血吸虫的表膜上也有该蛋白的存在,这也说明SjCRHSP与SjGCP相互作用是可能的。2.利用实时定量PCR技术对不同期别的虫体SjCRHSP-24基因转录水平进行分析,结果表明该基因在14d童虫体内转录水平最高。日本血吸虫感染宿主后第15、16天雌雄虫进行合抱、配偶,此前血吸虫应为合抱、配偶这个生理现象进行大量物质上的准备,SjCRHSP-24蛋白在这个时期高表达可能是为这些物质的表达调控应运而生的。3.通过血吸虫体外和体内干扰试验,并利用Real time PCR和Western blot等技术对干扰效果进行分析,结果显示无论是体内还是体外干扰,均能很好的抑制该基因的转录和表达;对体外干扰虫体进行显微观察,发现干扰后虫体的死亡率和畸形率有所增高,表明该基因可能与血吸虫的生长发育有关。4.对刺激机体产生的免疫类型进行分析发现,免疫鼠脾细胞经SjCRHSP-24蛋白刺激后产生的IL-4、IL-10、TNF-α、IFN-γ细胞因子含量比无刺激组皆明显升高。表明SjCRHSP-24蛋白即可引起机体产生Th1类型免疫反应,也刺激机体产生Th2型免疫反应。但主要是Th1型免疫反应,但IL-10的存在可阻滞机体产生过度的Th1型免疫反应。

全文目录


中文摘要  4-6
Abstract  6-10
符号说明  10-11
第一章 文献综述  11-21
  1 血吸虫研究概况  11-12
  2 分子生物学技术及其在寄生虫研究中的应用  12-19
    2.1 重组DNA 技术  13
    2.2 蛋白质组学技术  13-18
    2.3 RNAi 技术  18-19
   3 sjCRHSP-24 研究进展  19-21
第二章 SjCRHSP-24 的克隆、表达及在血吸虫体的 组织定位  21-43
  1 材料和方法  21-34
    1.1 材料  21-25
    1.2 方法  25-34
  2 结果  34-40
    2.1 sjCRHSP-24 基因原核表达质粒的构建  34-37
    2.2 sjCRHSP-24 基因在大肠杆菌的表达及重组蛋白的纯化  37
    2.3 sjCRHSP-24 重组蛋白的抗原性分析  37-40
    2.4 兔抗sjCRHSP-24血清的效价检测和Western blot分析  40
    2.5 荧光免疫定位  40
  3 讨论  40-43
第三章 SjCRHSP-24 在血吸虫发育不同时期的表达分析  43-48
  1 材料与方法  43-46
    1.1 材料  43-44
    1.2 方法  44-46
  2 结果  46-47
  3 讨论  47-48
第四章 RNA 干扰对 SjCRHSP-24 基因转录、表达及 血吸虫生长发育的影响  48-58
  1 材料与方法  48-52
    1.1 材料  48-50
    1.2 方法  50-52
  2 结果  52-56
    2.1 体外RNAi  52-56
    2.2 体内RNAi  56
  3 讨论  56-58
第五章 SjCRHSP-24 免疫保护功能的评估  58-65
  1 材料与方法  58-62
    1.1 材料  58-59
    1.2 方法  59-62
  2 结果  62-63
    2.1 ELISA 方法检测免疫保护小鼠抗体水平  62
    2.2 细胞因子分析  62-63
  3 讨论  63-65
第六章 全文结论  65-66
参考文献  66-71
致谢  71

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜寄生虫学
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