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鸡传染性支气管炎病毒RT-LAMP检测方法的建立及S1蛋白T细胞表位的筛选

作　者: 范瑾
导　师: 陈书明
学　校: 山西农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 鸡传染性支气管炎病毒逆转录-环介导等温扩增核酸疫苗细胞表位
分类号: S858.31
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

由传染性支气管炎病毒(IBV)引起的鸡传染性支气管炎(IB)是一种急性、高度接触性传染病,可引起各日龄鸡感染,是影响养禽业发展的主要疫病之一。IBV属冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属,该病毒血清型众多,其基因组RNA特有的先导引物转录机制使病毒呈高度变异性,给病毒的检测及疫病的防控带来极大的困难。为了探索IBV多表型通用检测方法和表位疫苗的研制,我们开展了如下研究：一、建立一种快速、灵敏、特异的检测鸡传染性支气管炎病毒的逆转录-环介导等温扩增方法(RT-LAMP).针对IBV毒株保守性N蛋白在线设计4对LAMP特异性引物,提取IBV RNA作为模板,在Bst DNA聚合酶作用下恒温反应,对IBV、新城疫病毒、禽流感病毒和鸡毒支原体进行特异性分析,并与普通RT-PCR进行灵敏度比较。结果表明RT-LAMP法在30min就能够检测出IBV毒株(M41株、H52株、H120株、AustraliaT株、4/91株、QX株),特异性良好且灵敏度是普通RT-PCR的107倍,阳性反应结果呈绿色,可眼观判断。是一种快速、灵敏、特异的检测IBV的方法。二、构建IBV M、S1核酸疫苗以及原核表达M、Sl蛋白并评价其免疫效果。真核表达质粒pVAX-M和pVAX-S1转染Hela细胞,Western-bolt和IFA检测结果表明,pVAX-M和pVAX-S1都可以在体外正常表达。分别使用pVAX-M、pVAX-S1以及pET-28a-M、pET-28a-S1免疫2周龄SPF鸡。利用ELISA方法检测体液免疫应答水平,四周后攻毒,排毒情况和病理切片结果表明,p VAX-S1免疫组抗体水平显著高于其他组(P<0.05)并且减少了IBV的排毒,攻毒保护效果更佳。因此选择多种亚型S1蛋白核酸疫苗进行功能性T细胞表位筛选。三、筛选IBV S1蛋白功能性T细胞表位。以IBV S1蛋白氨基酸序列为模板,利用生物信息学方法预测并合成了21条肽,分别以其为刺激物,采用ELIspot法测定不同亚型S1蛋白核酸疫苗免疫SPF鸡诱导脾淋巴细胞分泌IFN-γ的能力,通过3次独立的ELIspot实验,经生物统计分析获得优势表位肽。其中有9号、10号、16号、17号4条短肽可以单独刺激IBV三种不同亚型S1核酸疫苗免疫的鸡淋巴细胞产生IFN-γ(p<0.01),初步确定这些多肽为IBV SI蛋白功能性T细胞抗原表位。为后续研制IBV通用表位疫苗奠定基础。

全文目录

摘要  8-9
文献综述  9-20
  1 鸡传染性支气管炎病毒分子生物学研究概况  10-11
    1.1 IBV基因组结构特征  10
    1.2 IBV主要结构蛋白  10-11
  2 鸡传染性支气管炎病毒检测技术的研究进展  11-14
    2.1 中和试验  12
    2.2 血凝及血凝抑制试验  12
    2.3 琼脂扩散试验  12
    2.4 酶联免疫吸附试验  12-13
    2.5 免疫荧光技术  13
    2.6 聚合酶链式反应  13
    2.7 PCR产物的限制性内切酶片段多态性分析  13-14
    2.8 寡核苷酸序列图谱分析  14
  3 环等温扩增技术  14-18
    3.1 LAMP引物设计  14-15
    3.2 LAMP反应原理  15-18
  4 T细胞表位及ELIspot技术  18-20
    4.1 T细胞表位的概述  18
    4.2 ELIspot技术概述  18-20
实验一鸡传染性支气管炎病毒RT-LAMP检测方法的建立  20-28
  1 材料  20
    1.1 病毒  20
    1.2 主要试剂  20
  2 方法  20-22
    2.1 引物设计  20-21
    2.2 病毒RNA的提取  21
    2.3 反应条件的优化  21
    2.4 反应时间的优化  21
    2.5 灵敏度检测  21-22
    2.6 特异性检测  22
    2.7 IBV不同毒株的检测  22
  3 结果  22-25
    3.1 RT-LAMP反应条件的优化  22-23
    3.2 RT-LAMP反应时间的优化  23
    3.3 灵敏度检测  23-24
    3.4 RT-LAMP特异性检测  24-25
    3.5 IBV不同毒株的RT-LAMP检测  25
  4 讨论  25-28
实验二 IBV S1和M蛋白核酸疫苗的构建及鸡免疫保护试验  28-51
  1 材料  28-29
    1.1 毒株、细胞、载体  28
    1.2 实验动物  28
    1.3 主要试剂  28
    1.4 主要仪器  28-29
  2 方法  29-33
    2.1 M、S1蛋白多克隆抗体的制备  29-30
    2.2 M、S1蛋白真核表达质粒的构建、体外瞬时表达及表达产物的检测  30-32
    2.3 免疫保护实验  32-33
  3 实验结果  33-48
    3.1 M、S1基因原核表达质粒的构建  33-34
    3.2 pET 28a-M、pET 28a-S1诱导表达及纯化  34-37
    3.3 兔抗血清的Western-blot效价检测  37
    3.4 M、S1蛋白真核表达质粒的构建  37-39
    3.5 真核表达产物的Western-blot检测  39-40
    3.6 IFA检测真核表达质粒在体外的表达  40-42
    3.7 两次免疫后各组的抗体水平测定  42-43
    3.8 攻毒后排毒量检测  43-46
    3.9 剖检及病理切片结果  46-48
  4 讨论  48-51
实验三 IBV S1蛋白T细胞表位的筛选  51-59
  1 材料  51
    1.1 多肽  51
    1.2 主要试剂  51
    1.3 实验动物  51
    1.4 主要仪器  51
  2 方法  51-54
    2.1 多肽的设计  51-52
    2.2 动物免疫  52-53
    2.3 鸡脾淋巴细胞的制备  53
    2.4 IFN-γELIspot方法筛选肽  53-54
  3 结果  54-57
  4 讨论  57-59
结论  59-60
参考文献  60-63
Abstract  63-65
英文缩略表  65-67
致谢  67-68

鸡传染性支气管炎病毒RT-LAMP检测方法的建立及S1蛋白T细胞表位的筛选

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