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应用RT-LAMP技术检测肠道病毒Coxsackievirus A6的研究

作　者: 陈惠玲
导　师: 舒柏华
学　校: 华中科技大学
专　业: 卫生检验与检疫
关键词: 柯萨奇A组6型病毒 手足口病 逆转录环介导等温扩增
分类号: R512.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 5次
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内容摘要


目的：柯萨奇病毒A组6型病毒（coxsackievirus A6, CVA6）是引起手足口病的常见病原体，且其引起的手足口病常伴有甲病变等症状。本实验的目的在于建立一种适于广泛推广的检测CVA6的快速高效、灵敏特异的仅需在单个试管中一步完成的逆转录环介导等温扩增方法（reverse transcription loop-mediatedisothermal amplification，RT-LAMP），以满足快速识别CVA6感染的需要。方法：采集手足口病病人的粪便样本进行核酸扩增并鉴定分型后，选取合适标本用做反应模板。在GenBank上下载编码CVA6衣壳蛋白VP1的基因序列，利用在线软件设计针对CVA6基因组VP1片段保守区的引物，在特异性引物和具有链置换活性的Bst聚合酶作用下进行RT-LAMP反应，探索CVA6-RT-LAMP方法的最佳反应条件,肉眼观察扩增结果或取产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，验证其特异性并与常规的逆转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerasechain reaction, RT-PCR）比较灵敏度。利用荧光PCR仪得到扩增产物的熔解曲线。结果：优化后的CVA6-RT-LAMP体系特异性强，仅能扩增出CVA6核酸，与其他型别的肠道病毒不发生非特异性扩增反应；灵敏度高，约为CVA6-RT-PCR法的100倍；反应快速，可在40分钟内达到反应平台期；荧光熔解曲线呈单峰状，也说明反应产物单一，特异性强。结论：本实验建立的CVA6-RT-LAMP技术具有快速高效，灵敏度高、特异性强、操作简便、对仪器设备的要求低，结果判定方便等优点，适于广泛推广做为CVA6鉴定的方法，尤其适于在缺乏先进设备的基础单位推广。

全文目录


中文摘要  6-8
Abstract  8-10
1. 前言  10-13
2. 材料与方法  13-21
  2.1 标本来源  13
  2.2 仪器设备  13
  2.3 主要试剂  13-14
  2.4 标本亚型鉴定与标本分组  14-16
    2.4.1 标本前处理  14
    2.4.2 核酸提取及扩增  14-15
    2.4.3 扩增产物的纯化回收、测序  15-16
    2.4.4 亚型鉴定与分组  16
  2.5 引物设计  16-17
  2.6 CVA6-RT-LAMP 扩增体系反应条件的优化  17-19
    2.6.1 确定最佳扩增温度  17-18
    2.6.2 引物浓度优化  18
    2.6.3 Betaine 浓度优化  18
    2.6.4 Mg~(2+)浓度优化  18-19
    2.6.5 dNTP 浓度优化  19
    2.6.6 CVA6-RT-LAMP 体系反应时间的确定  19
  2.7 RT-LAMP 扩增产物的检测方法  19-20
  2.8 CVA6-RT-LAMP 方法的特异性  20
  2.9 CVA6-RT-LAMP 方法的灵敏度  20
  2.10 CVA6-RT-PCR 法的灵敏度  20-21
  2.11 CVA6-RT-LAMP 的实时监控  21
3. 结果  21-29
  3.1 CVA6-RT-LAMP 扩增体系反应条件的优化  21-25
    3.1.1 最佳扩增温度  21-22
    3.1.2 引物浓度优化  22-23
    3.1.3 Betaine 浓度优化  23
    3.1.4 Mg~(2+)浓度优化  23-24
    3.1.5 dNTP 浓度优化  24-25
    3.1.6 CVA6-RT-LAMP 体系反应时间的确定  25
  3.2 CVA6-RT-LAMP 反应的特异性  25-26
  3.3 CVA6-RT-LAMP 反应的灵敏度  26-27
  3.4 CVA6-RT-PCR 法的灵敏度  27-28
  3.5 CVA6-RT-LAMP 的实时监控  28-29
4. 讨论  29-33
  4.1 CVA6-RT-LAMP 体系的优化  29-30
  4.2 CVA6-RT-LAMP 体系的特异性和灵敏度  30-31
  4.3 CVA6-RT-LAMP 体系的优势和意义  31-33
参考文献  33-39
综述  39-57
  参考文献  51-57
附录：攻读硕士学位期间论文发表情况  57-58
致谢  58

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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 传染病 > 病毒传染病 > 肠道病毒感染
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