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猪瘟病毒抗体胶体金免疫层析快速检测试纸条的研制及初步应用

作　者: 尹梅
导　师: 姚火春；王永山
学　校: 南京农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪瘟病毒E2蛋白胶体金免疫层析试纸条猪瘟抗体检测
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

猪瘟(classical swine fever, CSF)是猪的一种高度接触性烈性传染病,被认为是严重危害和制约我国养猪业发展的重要传染病。尽管我国早在1956年就研制出了世界上最有效的猪瘟兔化弱毒疫苗,成功控制了猪瘟在我国的大规模爆发,但其一直没有得到根除。近年来,猪瘟在我国的流行呈现非典型性、慢性、持续性感染和隐性感染等新特点,免疫猪群发生猪瘟的情况越来越多,这些对猪瘟的预防和控制提出了新的挑战。我国现阶段主要采用ELISA方法对免疫猪群进行抗体水平的监测,该方法需要几小时才能完成,且要求有熟练的实验操作人员和特殊的仪器,不能满足临床实践中对抗体水平监测,快速、可靠、廉价的需求。因此,建立猪瘟病毒抗体的快速检测方法具有非常重要的意义。现有研究表明,猪瘟病毒的E2囊膜糖蛋白能刺激动物机体产生中和抗体,是CSFV最重要的保护性抗原,可用于建立猪瘟血清学检测方法。本研究利用原核表达的猪瘟E2融合蛋白,建立了检测猪瘟病毒抗体的双抗原夹心胶体金免疫层析方法,制备了快速检测试纸条,取得了如下研究结果：根据GenBank上发表的猪瘟病毒E2蛋白的基因序列,设计引物扩增去除信号肽和跨膜区的大小约560bp的E2基因片段。将该片段定向插入到原核表达载体pET-32a (＋)中,成功构建高效表达载体pET-32a-E2,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳分析初步确定融合蛋白在上清中表达,大小约为38KDa。E2蛋白经镍柱纯化后进行Western blotting分析,表明融合蛋白E2-pET32a具有免疫原性。用纯化的E2蛋白免疫新西兰白兔制备兔抗E2蛋白多克隆抗体,抗血清经粗提和纯化,抗体蛋白的浓度为2.1mg/ml.采用柠檬酸三钠还原法,制备的胶体金颗粒的直径为20-30nm,质量良好。选用猪瘟重组E2蛋白标记胶体金作为捕捉抗原,将纯化的E2蛋白和兔抗E2多克隆抗体包被在硝酸纤维素膜(NC)的检测线和质控线上,制备猪瘟抗体胶体金免疫层析检测试纸条。经试验证实,胶体金标记蛋白的最适pH值为7.5,E2蛋白最适标记量为9.6mg/ml;最佳的蛋白包被液为0.01mol/LpH7.2的PB+0.1%BSA; E2蛋白的最佳包被浓度为1.5mg/ml;兔抗E2IgG最佳包被浓度为1.0mg/ml;最佳封闭液配方为：0.5%PVP+0.75%吐温-20+0.5%PEG20000+2%BSA+0.02%NaN3+10mM pH7.2PBS.对试纸条进行了特异性检测,结果显示试纸条特异性良好,不与BVDV, PRRSV和PCV2抗体发生交叉反应。并且稀释CSFV标准抗体到1：16时仍可以检测到条带,说明试纸条灵敏度尚可。应用制备的CSFV抗体检测试纸条和IDEXX的猪瘟抗体ELISA检测试剂盒,分别检测来自江苏太湖和浦口的共计80份血清样品,两种检测方法的符合率为90.3%。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
缩略语表  10-11
第一篇文献综述  11-27
  1 概述  11
  2 猪瘟的流行和分布  11-12
  3 猪瘟病毒的病原学特性  12-14
    3.1 病原学  12-13
    3.2 猪瘟病毒的基因结构  13
    3.3 猪瘟病毒的结构蛋白及其功能  13-14
  4 实验室四种常规诊断技术  14-16
    4.1 病毒分离鉴定  14
    4.2 荧光抗体法  14-15
    4.3 反转录-聚合酶链反应  15
    4.4 酶联免疫吸附试验  15-16
  5 胶体金免疫层析技术  16-22
    5.1 胶体金免疫层析技术研究进展  16-17
    5.2 胶体金的特性  17-18
    5.3 胶体金的制备  18
    5.4 免疫胶体金的制备、纯化及保存  18-19
    5.5 胶体金免疫层析技术原理  19-20
    5.6 胶体金免疫层析技术在兽医领域的应用  20-22
  参考文献  22-27
第二篇试验研究  27-55
  第一章猪瘟病毒囊膜糖蛋白E2基因在大肠杆菌的高效表达及表达产物的纯化制备  27-41
    摘要  27
    1 材料与方法  27-35
      1.1 材料  27-28
      1.2 目的基因的扩增  28-30
      1.3 质粒pET-32a(+)的提取及双酶切  30-31
      1.4 原核表达载体pET-32a-E2的构建  31-32
      1.5 重组质粒的诱导表达  32
      1.6 SDS-PAGE检测表达产物  32-33
      1.7 目的蛋白的纯化  33-34
      1.8 Western Blot检测蛋白的免疫学活性  34
      1.9 兔抗E2蛋白多克隆抗体的制备和纯化  34-35
    2 结果  35-39
      2.1 原核表达载体E2-pET32a的构建  35-36
      2.2 SDS-PAGE检测表达产物  36-37
      2.3 蛋白的纯化与免疫学活性鉴定  37-38
      2.4 兔抗E2蛋白多克隆抗体的制备  38-39
    3 讨论  39-41
  第二章猪瘟抗体试纸条检测方法的建立  41-55
    摘要  41
    1 材料与方法  41-47
      1.1 材料  41
      1.2 胶体金的制备  41-42
      1.3 胶体金的质量鉴定  42
      1.4 金标抗原的制备  42-44
      1.5 试纸条各种条件的优化  44-45
      1.6 猪瘟抗体免疫层析快速检测试纸条的研制  45-46
      1.7 试纸条性能的测定  46
      1.8 临床应用试验  46-47
    2 结果  47-52
      2.1 胶体金的制备及质量鉴定  47-48
      2.2 胶体金最佳标记条件的确定  48-49
      2.3 试纸条各种条件的优化  49-50
      2.4 试纸条性能的测定  50-51
      2.5 临床应用试验  51-52
    3 讨论  52-55
      3.1 胶体金免疫层析法检测模式的选择  52
      3.2 影响胶体金制备的因素  52-53
      3.3 试纸条的性能  53-54
      3.4 胶体金免疫层析技术的优势  54-55
参考文献  55-57
全文总结  57-59
附录  59-63
致谢  63

猪瘟病毒抗体胶体金免疫层析快速检测试纸条的研制及初步应用

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