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黄海希瓦氏菌胶体金免疫层析试纸条的研制

作　者: 刘志强
导　师: 李强
学　校:
专　业: 水产养殖
关键词: 黄海希瓦氏菌 胶体金免疫层析 试纸条快速检测
分类号: S947.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
下　载: 3次
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内容摘要


刺参富含刺参粘多糖、蛋白质、氨基酸、刺参皂苷等营养，由于其较高的经济价值与营养价值，我国刺参养殖规模增长迅速，但是养殖模式的不够成熟及生产过程中的不规范操作，刺参病害问题日渐突出，其中由细菌感染引起的化皮病是当前养殖刺参中最常见、危害最为严重的疾病。该病存在明显的病原多样性和地区差异，黄海希瓦氏菌（Shewanella smarflavi）是引起辽宁刺参化皮病的重要病原菌，导致养殖过程中刺参大量死亡，造成巨大的经济损失，严重危害刺参养殖业的发展。水产养殖中针对水生动物疾病的爆发无非就是要做到快速、准确的诊断，而通常病原菌引起大规模疾病的爆发都有一段潜伏期，在这段时间内，动物本体往往没有太明显的症状，这就造成了疾病确诊的延误，从而耽误了疾病治疗的最佳时机。目前针对黄海希瓦氏菌检测的生理生化方法、分子生物学鉴定法及ELISA法都不同程度需要专业操作技术人员且耗时过久，在基层无法操作检测，为了达到疾病早期确诊，这就要求一种快速、简便、准确的检测方法。胶体金免疫层析技术(GICA)是一种以胶体金为标记物的快速免疫结合分析技术，通过该技术建立的试纸条是一种新型体外检测工具，具有简便快速、肉眼判断、放大反应等优点，能极大满足基层现场检测黄海希瓦氏菌的所有要求，无需专业人员即可定期进行检测，从而达到对病原菌感染养殖动物引起疾病起到良好的监测作用。本研究前期先行制备抗黄海希瓦氏菌单克隆抗体及多克隆抗体，为试纸条的研制准备材料，应用双抗夹心法建立了检测黄海希瓦氏菌的GICA方法，对胶体金标记单抗、抗体喷涂等各项指标进行优化，并确定了最佳条件，成功研制了黄海希瓦氏菌胶体金免疫层析试纸条。本研究所研制的试纸条对黄海希瓦氏菌进行检测，5~10min肉眼即可判读结果，检测灵敏度达到105CFU／mL，最佳检测浓度为5×105~5×106CFU／mL。试纸条分别对两个浓度5×105、5×107CFU／mL的希瓦氏菌（KCCM41821)、迟钝爱德华菌(ATCC15947)、杀鲑气单胞菌(MT004)、河豚链球菌(KCTC3657)、哈维弧菌(ATCC14126)、灿烂弧菌(ATCC33125)、美人鱼弧菌(ATCC33539)、副溶血弧菌KCTC2471)、溶藻弧菌(KCCM40513)、创伤弧菌(ATCC2126)、鳗弧菌(KCTC2711)12株菌均无交叉反应。4℃或37℃存放6个月，检测结果稳定。该试纸条检测灵敏度高、特异性强，稳定性好，而且无需检测仪器即可检测黄海希瓦氏菌，特别适用于基层推广使用，可以对该菌引起的仿刺参疾病起到良好的监测作用。

全文目录


摘要  3-4
Abstract  4-9
第一章 前言  9-17
  1 黄海希瓦氏菌的研究进展  9-10
    1.1 黄海希瓦氏菌的分类地位及生物学特性  9
    1.2 黄海希瓦氏菌的感染症状及致病性  9-10
    1.3 黄海希瓦氏菌的诊断方法  10
  2 胶体金免疫层析技术在水产养殖界中的推广及应用  10-17
    2.1 胶体金免疫层析（GICA）的原理  10-11
    2.2 胶体金免疫层析技术在水产养殖业中的应用  11-17
      2.2.1 胶体金免疫层析技术在水产动物病原微生物检测中的应用  11-13
      2.2.2 胶体金免疫层析技术在水产动物药物残留检测中的应用  13-16
      2.2.3 胶体金免疫层析技术在水产养殖其他领域中的应用  16-17
第二章 黄海希瓦氏菌单克隆抗体的生产、纯化及特性分析  17-24
  1 材料与方法  17-20
    1.1 材料  17-18
    1.2 方法  18-20
      1.2.1 抗原的制备  18
      1.2.2 单克隆抗体的生产  18-19
      1.2.3 单克隆抗体的纯化、浓度鉴定  19-20
  2 结果  20-23
    2.1 杂交瘤细胞培养上清效价的测定  20
    2.2 杂交瘤细胞培养的特异性检测  20-21
    2.3 腹水效价的测定  21
    2.4 抗黄海希瓦氏菌单克隆抗体的纯度鉴定及浓度测定  21-22
    2.5 纯化后抗体效价的测定  22-23
  3 讨论  23-24
第三章 黄海希瓦氏菌多克隆抗体的生产、纯化及制备  24-29
  1 材料与方法  24-26
    1.1 材料  24
    1.2 方法  24-26
      1.2.1 抗原的制备  24
      1.2.2 多克隆抗体的制备  24-25
      1.2.3 多克隆抗体的纯化及特性分析  25-26
  2 结果  26-27
    2.1 未纯化多克隆抗体效价测定  26
    2.2 纯化后多克隆抗体的纯度及蛋白浓度  26-27
    2.3 纯化后多克隆抗体效价测定  27
  3 讨论  27-29
第四章 胶体金免疫体系的建立  29-36
  1 材料和方法  29-31
    1.1 材料  29
    1.2 方法  29-31
      1.2.1 单抗—胶体金复合物的制备及纯化  29-31
      1.2.2 金标垫、检测线及质控线上抗体最适喷涂量的确定  31
  2 结果  31-34
    2.1 金标单抗的制备及纯化  31-33
      2.1.1 胶体金标记抗体最低稳定量的测定  31-32
      2.1.2 胶体金标记抗体最适 pH 的测定  32-33
    2.2 胶体金单抗活性检测  33
    2.3 金标垫及检测线及质控线上抗体最适喷涂量的确定  33-34
  3 讨论  34-36
第五章 胶体金试纸条的组装及评价  36-43
  1 材料和方法  36-38
    1.1 材料  36
    1.2 方法  36-38
      1.2.1 黄海希瓦氏菌胶体金免疫层析试纸条的组装  36-37
      1.2.2 试纸条检测结果的判定  37
      1.2.3 黄海希瓦氏菌胶体金试纸条性能评价  37-38
  2 结果  38-42
    2.1 试纸条对单菌悬液灵敏度、特异性的测定  38-40
    2.2 试纸条对混合菌悬液特异性及灵敏度的检测  40-41
    2.3 人工增菌实验  41
    2.4 试纸条的稳定性检测  41-42
  3 讨论  42-43
结论  43-44
参考文献  44-51
附录  51-55
攻读硕士学位期间发表论文及发明专利  55-56
致谢  56

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产保护学 > 其他水产病虫害及其防治 > 其他
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