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氧氟沙星噬菌体抗体库构建及筛选

作　者: 杨青
导　师: 王硕
学　校: 天津科技大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 氧氟沙星噬菌体展示单链抗体
分类号: S859.84
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

食品安全已经成为一个世界性的挑战和全球重要的公共卫生问题,其中动物源性食品安全是世界关注的一个焦点,其中兽药残留问题是影响动物源性食品安全的主要因素之一,喹诺酮类兽药中的氧氟沙星以其诸多优点被广泛使用,因此其在动物源性食品中残留的可能性非常大。ELISA方法逐渐成为一种成熟的药物残留快速分析方法,而获得理想的抗体是制约ELISA方法发展的主要瓶颈问题。为了获取更为有效的抗体,本研究构建了氧氟沙星特异性噬菌体抗体库,并对抗体库进行了淘选。从106-107个分泌氧氟沙星抗体的杂交瘤细胞中提取总RNA,对总RNA进行反转录获得cDNA,利用兼并引物分别扩增得到长度约为450bp的重链可变区基因VH及长度约为440bp的轻链可变区基因VL,通过重叠延伸PCR拼接为单链抗体(scFv)基因片段,其长度约为780bp。经限制性内切酶EcoR Ⅰ和HindⅡ双酶切后,用T4DNA连接酶将其与T7噬菌体载体进行连接,进行蛋白包装之后成功构建氧氟沙星噬菌体抗体库,经检测原始噬菌体抗体库的滴度为2.4x105pfu。将原始抗体库进行液体扩增,经检测扩增后的噬菌体抗体库滴度为1.2×1012pfu/mL。以氧氟沙星-OVA(鸡卵白蛋白)为配体对抗体库进行淘选,每轮淘选的噬菌体投入量为1010pfu/mL,共进行4轮淘选。在淘选过程中,分别对封闭条件和洗脱方法进行了优化。封闭液分别用5%BSA、5%乳粉、10%乳粉进行对比,结果显示5%BSA效果较好。淘选后的洗脱尝试了两种洗脱方法：用1%SDS进行洗脱的方法和用对数期的宿主菌(BLT5403)进行原位洗脱的方法,结果显示原位洗脱方法具有较好的效果。从第四轮淘选的平板中挑取138个噬菌体单克隆,分别抠斑浸于提取缓冲液中,4℃过夜之后,以其为模板进行PCR验证,结果表明83%的克隆含有正确长度的单链抗体基因。通过噬菌体ELISA对淘选后噬菌体克隆的特异性进行检测,结果显示4个克隆体现出较高的特异性,1μg/mL标准品对其抑制率分别为31%,35%,33%,78%。对特异性最高的单链抗体基因进行测序分析,该单链抗体重链由117个氨基酸构成,轻链由108个氨基酸构成。本研究的开展,为氧氟沙星新型抗体的制备及其免疫检测方法的技术进步奠定了基础。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-8
1 前言  8-19
  1.1 兽药残留概述  8-9
    1.1.1 兽药残留的原因  8
    1.1.2 动物性食品中兽药残留的危害  8-9
    1.1.3 兽药残留监测监控状况  9
  1.2 动物性食品中喹诺酮类药物残留  9-11
    1.2.1 喹诺酮类药物概述  9-10
    1.2.2 喹诺酮类药物的理化特性  10-11
    1.2.3 喹诺酮类药物残留的危害  11
  1.3 喹诺酮类药物残留检测研究进展  11-14
    1.3.1 微生物检测法  11-12
    1.3.2 免疫分析法(IAs)  12
    1.3.3 色谱法  12-13
    1.3.4 液-质联用法  13
    1.3.5 高效毛细管电泳分析法  13-14
  1.4 氧氟沙星概述  14
  1.5 基因工程抗体  14-15
    1.5.1 抗体简介  14-15
    1.5.2 基因工程抗体  15
  1.6 噬菌体抗体库技术  15-18
    1.6.1 噬菌体抗体库技术简介  15-16
    1.6.2 噬菌体抗体库技术原理  16
    1.6.3 根据噬菌体载体的类型分类  16
    1.6.4 噬菌体抗体库技术的优点  16-17
    1.6.5 噬菌体抗体库技术的应用及其研究进展  17-18
  1.7 论文研究的目的及意义  18-19
2 材料与方法  19-40
  2.1 实验材料  19-25
    2.1.1 实验所用的单克隆抗体细胞及菌种  19
    2.1.2 实验所用的工具酶、抗生素和载体  19
    2.1.3 实验所需试剂  19-21
    2.1.4 实验所用试剂盒  21
    2.1.5 实验所用仪器  21-22
    2.1.6 PCR扩增所用的引物  22-24
    2.1.7 主要溶液和培养基的配置方法  24-25
  2.2 实验方法  25-40
    2.2.1 提取氧氟沙星单克隆细胞的总RNA  25-27
    2.2.2 cDNA第一链的合成  27-28
    2.2.3 单链抗体基因片段扩增  28-29
    2.2.4 重叠延伸PCR  29-30
    2.2.5 抗体库构建  30-33
    2.2.6 抗体库淘选  33-35
    2.2.7 淘选后噬菌体的ELISA筛选  35
    2.2.8 筛选后噬菌体scFv基因克隆  35-40
3 实验结果与分析  40-48
  3.1 氧氟沙星单克隆抗体细胞总RNA的提取  40
  3.2 氧氟沙星重链V_H基因和轻链V_L基因片段的扩增  40-41
  3.3 氧氟沙星单抗细胞scFv片段的扩增  41
  3.4 噬菌体单链抗体库的构建  41-42
  3.5 原始抗体库质量检测  42-43
  3.6 噬菌体抗体库的淘选及PCR验证  43-45
    3.6.1 淘选  43-44
    3.6.2 淘选之后的PCR验证  44-45
  3.7 淘选后噬菌体的ELISA筛选  45
  3.8 对筛选后的重组scFv基因克隆  45-46
  3.9 质粒PCR与酶切验证  46-47
  3.10 测序  47-48
4 结论  48-49
5 展望  49-50
6 参考文献  50-57
7 攻读硕士学位期间发表论文情况  57-58
8 致谢  58

氧氟沙星噬菌体抗体库构建及筛选

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