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桃树组蛋白H3.3基因（PpH3.3）的克隆及表达特性研究

作　者: 冷传远
导　师: 高东升
学　校: 山东农业大学
专　业: 果树学
关键词: 组蛋白H3.3 曙光油桃休眠 RACE 转基因杨树
分类号: S662.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

作为一种重要的生命现象，落叶果树芽休眠的形成和解除对多年生植物而言至关重要。休眠机理的研究已在多个物种中展开，涉及生理学、细胞学和分子生物学等多个领域。研究发现染色体的重构与休眠有关。作为染色体的重要组成成分，组蛋白H3与组蛋白H2A、H2B、H3和H4形成核小体八聚体核心，对维持染色质的结构和功能有重要作用。本研究于2010-2013年在山东农业大学园艺试验站和设施果树实验室进行，以‘曙光’油桃（(Prunus persica var. nectariana cv. Shuguang)）为实验材料，从其花芽中克隆到组蛋白H3变体基因，对其进行序列比对、表达特性分析和休眠过程中功能的初步鉴定。主要结果如下：(1)利用实验室构建的休眠期和休眠解除期的抑制差减文库筛选到的部分片段，通过RACE的方法克隆到基因全长，命名为PpH3.3, GenBank登录号为KC907628。其全长cDNA为821bp，编码含有136个氨基酸的蛋白质。序列分析发现含有组蛋白H3典型结构域N-terminal tail和H3fold domain。序列比对发现PpH3.3编码的氨基酸序列与拟南芥、葡萄的H3.3序列相同。cDNA序列和基因组序列比对发现，PpH3.3基因组DNA含有4个内含子，其中1个内含子位于5′UTR和第1个外显子之间。(2)通过hiTAIL-PCR的方法，克隆到目的基因的上游启动子序列，序列全长1547bp。软件分析发现含有大量的光响应元件，如3-AF1binding site, Box4, C-box, G-box,CATT motif, GT1motif, GTGGC motif, TCT motif和SP1。将启动子连接表达载体pCAMBIA1301，转化拟南芥，GUS染色后发现PpH3.3在根、茎、叶和果莢中表达水平较高。(3)通过定量分析的方法研究在自然休眠进程和不同破眠处理后PpH3.3的表达变化。PpH3.3在休眠期的表达量高于休眠诱导期和休眠解除期。高温和单氰胺处理后，虽然PpH3.3表达变化的程度和时间不同，但2种处理呈现相同的变化趋势，即PpH3.3的表达均先升高，后降低，出现短暂高峰。(4)构建正义植物表达载体pROKII-PpH3.3，采用农杆菌介导的方法，转化84k杨树，同时转空载体作为对照。经卡那霉素筛选获得若干再生植株，PCR鉴定发现PpH3.3在转基因杨树84k中得到成功表达。

全文目录

中文摘要  10-11
Abstract  11-13
1 前言  13-29
  1.1 休眠概述  13-21
    1.1.1 休眠的定义  13-14
    1.1.2 休眠的界定  14
    1.1.3 休眠的分类  14
    1.1.4 休眠与细胞分裂  14-16
    1.1.5 类休眠  16-17
    1.1.6 内休眠  17-20
      1.1.6.1 生长停止：使内休眠建立  17-19
      1.1.6.2 内休眠的建立：使分生组织对促进生长的信号不敏感  19
      1.1.6.3 内休眠的保持  19-20
      1.1.6.4 内休眠的解除：能够生长  20
    1.1.7 生态休眠  20-21
  1.2 组蛋白  21-27
    1.2.1 组蛋白共价修饰  21-25
      1.2.1.1 组蛋白乙酰化修饰  21-23
      1.2.1.2 组蛋白的泛素化修饰  23-24
      1.2.1.3 组蛋白甲基化和去甲基化  24-25
    1.2.2 组蛋白变体  25-27
      1.2.2.1 H3 变体 H3.3  25-26
      1.2.2.2 H3.3 在基因组的特定位置富集  26-27
  1.3 休眠与表观遗传  27-28
  1.4 本研究的目的及意义  28-29
2 实验材料与方法  29-48
  2.1 实验材料与处理  29-31
    2.1.1 植物材料  29
    2.1.2 实验处理  29
    2.1.3 菌株和载体  29
    2.1.4 生化试剂  29
    2.1.5 引物  29-31
  2.2 试验方法  31-48
    2.2.1 RNA 提取  31
      2.2.1.1 改良 CTAB 法  31
    2.2.2 基因组 DNA 去除  31-32
    2.2.3 cDNA 第一条链的合成  32-33
    2.2.4 cDNA 全长序列的获得  33-38
      2.2.4.1 PpH3.3 中间片段获得  33
      2.2.4.2 PpH3.33′端序列的获得  33-34
      2.2.4.3 PpH3.35′端序列的获得  34-37
      2.2.4.4 cDNA 全长序列的获得  37-38
    2.2.5 PpH3.3 全长基因组序列的获得  38-39
      2.2.5.1 CTAB 法提取心叶烟基因组总 DNA  38
      2.2.5.2 总 DNA 提取产物的纯化  38-39
      2.2.5.3 基因组扩增反应  39
    2.2.6 启动子的分离  39-40
    2.2.7 电泳目的片段的回收  40-41
    2.2.8 DNA 片段与克隆载体的连接  41
    2.2.9 大肠杆菌感受态细胞制备  41-42
    2.2.10 大肠杆菌感受态细胞的转化  42
    2.2.11 试剂盒质粒微量提取方案  42-43
    2.2.12 定量分析  43-44
      2.2.12.1 总 RNA 的提取  43
      2.2.12.2 反转录 cDNA 第一条链的合成  43-44
    2.2.13 植物表达载体的构建与转化  44-46
      2.2.13.1 杨树表达载体构建  44
      2.2.13.2 农杆菌 LBA4404 感受态制备  44
      2.2.13.3 冻融法转化农杆菌  44-45
      2.2.13.4 农杆菌介导转化杨树 84K  45-46
    2.2.14 PpH3.3 启动子表达载体的构建  46-47
      2.2.14.1 杨树表达载体构建  46
      2.2.14.2 拟南芥的转化  46-47
    2.2.15 GUS 组织化学染色  47-48
3 结果与分析  48-61
  3.1 PpH3.3 的分离  48-50
    3.1.1 RNA 的提取及反转录  48
    3.1.2 PpH3.33′片段的分离  48-49
    3.1.3 PpH3.35′片段的分离  49
    3.1.4 PpH3.3 全长 cDNA 的分离  49-50
  3.2 PpH3.3 的序列分析  50-53
    3.2.1 PpH3.3 的全长 cDNA 分析  50-51
    3.2.2 PpH3.3 编码的蛋白质序列分析  51
    3.2.3 PpH3.3 进化树分析  51-53
  3.3 PpH3.3 基因组序列分析  53-54
  3.4 PpH3.3 启动子序列分析  54-55
  3.5 PpH3.3 基因的表达特性分析  55-57
    3.5.1 自然休眠进程中 PpH3.3 的表达变化  55-56
    3.5.2 高温和单氰胺对 PpH3.3 表达的影响  56-57
  3.6 转拟南芥表达载体的构建  57-58
  3.7 GUS 染色  58
  3.8 转杨树 84K 正义表达载体的构建  58-59
  3.9 转基因再生植株的获得  59
  3.10 转基因植株的 PCR 鉴定  59-60
  3.11 下一步的计划  60-61
讨论  61-63
结论  63-64
参考文献  64-83
致谢  83-84
攻读学位期间发表的学术论文  84

桃树组蛋白H3.3基因（PpH3.3）的克隆及表达特性研究

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