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逆转座子atr1诱导元帅系苹果短枝变异分子机理的初步研究

作　者: 郭静
导　师: 孙俊
学　校: 安徽农业大学
专　业: 果树学
关键词: 苹果逆转座子 IRAP标记反向PCR 热不对称交错PCR
分类号: S661.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

前期研究表明逆转座子atr1参与了苹果元帅系的短枝变异，为揭示其变异机理，本研究借助已获得的atr1-LTRs和IPCR技术分离了atr1部分序列；利用IRAP-PCR在元帅系短枝变异品种中分离出一条特异性片段，并以此为切入点，在“元帅”短枝变异品种中获得了特异片段的部分侧翼序列，序列比对结果表明四个短枝变异品种中特异性片段相同，本研究为揭示逆转座子诱导苹果短枝变异机理提供了基础。1、逆转座子atr1-LTRs部分侧翼序列。根据前期获得atr1-LTRs的500bp片段，利用IPCR分离其侧翼序列。借助atr1-LTRs设计两对反向引物，利用限制性内切酶HindⅢ对“玫瑰红”基因组DNA进行充分酶切后，用T4连接酶将酶切片段连接成环作为PCR模板。两轮巢式PCR后，测序得到一条片段大小为1896bp。将该片段与先前的atr1-LTRs片段拼接后设计验证引物，在“玫瑰红”基因组DNA中进行扩增，最终测序得到一条2124bp的片段。分析表明其中包含了“逆转录酶基因（RT）的部分片段、RNaseH和3’-LTR部分及其侧翼序列”。2、基于atr1的苹果元帅系短枝变异品种特异性片段的分离。以苹果“元帅”及其短枝变异品种“华帅1号”、“矮红”、“奥勒冈矮生”和“玫瑰红”的基因组DNA为模板，利用atr1-LTRs设计引物，根据优化的IRAP-PCR体系和程序，扩增出“元帅”及其短枝变异品种指纹图谱，并分离出一条差异条带。测序结果中，“华帅1号”得到两条长度分别是809bp和758bp的特异片段，命名为Hs1和Hs1’，“矮红”、“奥勒冈矮生”和“玫瑰红”品种分别得到了一条长度为809bp的特异片段，命名为Ah1、Alg1和Mgh1。在此基础上，每条特异片段设计一条较长的引物，分别在“元帅”及其短枝变异品种进行验证，成功将IRAP标记转化为SCAR标记。3、TAIL-PCR分离元帅系短枝变异品种中特异片段的侧翼序列。先根据Mgh1设计三条巢式特异引物，与简并引物相结合，优化了三轮PCR扩增体系和程序，得到测序结果后与Mgh1序列拼接并设计验证引物，在“元帅”及其短枝变异品种扩增，得到特异片段Hs2、Ah2、Alg2和Mgh2。再根据Hs2设计三条巢式特异引物，与简并引物相结合，经过三轮PCR扩增，得到测序结果后与Hs2序列拼接并设计验证引物，在“元帅”及其短枝变异品种扩增，最终得到特异片段Hs3、Ah3、Alg3和Mgh3。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-8
1 文献综述  8-15
  1.1 苹果芽变育种的现状以及研究意义  8-9
    1.1.1 苹果芽变育种的现状  8
    1.1.2 苹果芽变育种的研究意义  8-9
  1.2 苹果芽变的研究进展  9-10
    1.2.1 芽变机理的研究方法及进展  9-10
    1.2.2 苹果短枝型芽变的研究进展  10
  1.3 植物逆转座子研究进展  10-12
    1.3.1 逆转座子的分类及结构  10-11
    1.3.2 植物逆转座子特性  11
    1.3.3 基于植物逆转座子的分子标记及其应用  11-12
  1.4 关于 SCAR 标记的研究  12
  1.5 两种方法扩增已知片段旁侧序列的研究进展  12-14
    1.5.1 IPCR 扩增旁侧序列  12-13
    1.5.2 TAIL-PCR 扩增旁侧序列  13-14
  1.6 展望  14-15
2 引言  15-17
  2.1 研究目的与意义  15-16
  2.2 研究内容  16-17
    2.2.1 反向 PCR 扩增逆转座子 atr1 的部分序列  16
    2.2.2 苹果元帅系短枝变异品种中特异性片段的分离  16
    2.2.3 短枝变异品种中特异片段侧翼序列的分离  16-17
3 材料与方法  17-24
  3.1 材料  17
  3.2 试验方法  17-24
    3.2.1 基因组 DNA 的提取  17
    3.2.2 DNA 的检测与定量  17-18
    3.2.3 目的产物的回收与纯化  18
    3.2.4 回收产物与 pMD18-T 载体的连接  18
    3.2.5 回收产物与 pEASY-T1 载体的连接  18
    3.2.6 大肠杆菌 DH5a 感受态细胞的制备及质粒的转化  18-19
    3.2.7 目的片段检测  19
    3.2.8 IPCR 扩增 atr1-LTRs 旁侧序列  19-20
      3.2.8.1 反向引物设计  19
      3.2.8.2 酶切与自身环化连接体系  19-20
      3.2.8.3 反应体系及程序  20
      3.2.8.4 目的条带的克隆及测序  20
      3.2.8.5 目的条带的验证  20
    3.2.9 苹果元帅系短枝变异品种的 IRAP-PCR 扩增  20
    3.2.10 特异片段转化的验证  20-21
    3.2.11 TAIL-PCR 扩增“玫瑰红”中特异片段的侧翼序列  21-22
      3.2.11.1 引物设计  21
      3.2.11.2 反应体系和程序  21-22
      3.2.11.3 分离、测序及序列验证  22
    3.2.12 TAIL-PCR 扩增“华帅 1 号”特异片段的侧翼序列  22-24
      3.2.12.1 引物设计  22
      3.2.12.2 反应体系和程序  22-23
      3.2.12.3 分离、测序及验证  23-24
4 结果与分析  24-36
  4.1 苹果基因组 DNA 的提取  24
  4.2 IPCR 扩增 atr1-LTRs 侧翼序列  24-28
    4.2.1 反向 PCR 结果  24-25
    4.2.2 atr1-LTRs 片段的验证  25-28
  4.3 苹果元帅短枝变异品种的 IRAP-PCR 扩增  28-29
  4.4 特异片段的验证  29-30
  4.5 TAIL-PCR 扩增“玫瑰红”特异片段 Mgh1 的侧翼序列  30-32
  4.6 TAIL-PCR 扩增“华帅 1 号”特异片段 Hs2 的侧翼序列  32-36
5 讨论  36-38
  5.1 IPCR 的应用及存在的问题  36
  5.2 IPAR 标记的应用潜力  36-37
  5.3 关于 SCAR 标记转化的研究  37
  5.4 TAIL-PCR 的应用及存在的问题  37-38
6 结论  38-39
参考文献  39-44
致谢  44-45
作者简介  45

逆转座子atr1诱导元帅系苹果短枝变异分子机理的初步研究

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