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用于提高体内外基因转染功效的亚油酸和聚苹果酸双接枝壳聚糖新型纳米载体

作 者: 王冰清
导 师: 印春华
学 校: 复旦大学
专 业: 生物化学与分子生物学
关键词: 壳聚糖 亚油酸 聚苹果酸 两亲性修饰壳聚糖 pEGFP 基因纳米复合物 基因转染 转染机制
分类号: R450
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要


外源基因实现治疗潜能需合适的递送载体。壳聚糖生物相容、生物可降解,在基因递送中显示巨大的潜力,但壳聚糖/pDNA纳米复合物转染效率低,需功能化修饰,以克服基因递送屏障。亚油酸聚苹果酸双接枝壳聚糖(LMC)聚合物是疏水性亚油酸和亲水性聚苹果酸修饰壳聚糖而成的两亲性壳聚糖衍生物,水中可自组装形成LMC纳米粒。结合亲水修饰和疏水修饰的特性,可用作基因的高效递送载体。合成不同亚油酸和聚苹果酸接枝比的LMC纳米粒,包载表达绿色荧光蛋白的模式质粒pEGFP,制备LMC/pEGFP纳米复合物,考察LMC亲水修饰和疏水修饰与LMC/pEGFP纳米复合物的构效关系,研究纳米复合物体内外转染效率。1LMC纳米粒合成与表征选择合适投料比合成不同亚油酸和聚苹果酸接枝比的LMC(LMC1、LMC2、LMC3和LMC4)纳米粒,分别测定接枝比、细胞毒性、接触角、粒径和Zeta电势。LMC1、LMC2、LMC3和LMC4纳米粒的亚油酸接枝比分别为23.3%、46.6%、70.0%和73.3%,聚苹果酸接枝比分别为3%、3%、3%和7%;LMC纳米粒粒径为150-300 nm; pH 5.5时Zeta电势为32.9-50.9 mV,有利于结合荷负电pEGFP;浓度低于1 mg/mL时,LMC纳米粒无细胞毒性,安全性良好。2 LMC/pEGFP纳米复合物制备和表征pH 5.5时LMC纳米粒经静电作用缩合pEGFP,形成LMC/pEGFP纳米复合物,包封率大于85%,pEGFP结合能力与壳聚糖基本相当。LMC/pEGFP纳米复合物为球形,粒径随质量比增加而增大,均略小于空白LMC纳米粒。LMC/pEGFP纳米复合物抗非特异性蛋白吸附能力与pEGFP释放速率随亚油酸和聚苹果酸接枝比增加而提高,均显著高于壳聚糖/pEGFP纳米复合物。LMC/pEGFP纳米复合物抗酶解能力随亚油酸接枝比增加而提高,但随聚苹果酸接枝比增加而降低,除LMC4/pEGFP纳米复合物外,LMC/pEGFP纳米复合物抗酶解能力均显著高于壳聚糖/pEGFP纳米复合物。3 LMC/pEGFP纳米复合物的细胞黏附、细胞摄取、摄取机制和核质分布研究了LMC/pEGFP纳米复合物的细胞黏附、细胞摄取、摄取机制和核质分布百分率,结果表明LMC/pEGFP纳米复合物的细胞黏附率和细胞摄取率较壳聚糖/pEGFP纳米复合物分别高0.8-3.8和1.7-3.2倍,且随亚油酸接枝比增加而增加及随聚苹果酸接枝比增加而降低。LMC3/pEGFP纳米复合物主要经能量依赖的、网格蛋白介导的内吞途径入胞,与细胞骨架重构和小窝蛋白介导的途径无关。LMC/pEGFP纳米复合物的细胞核质粒分布百分率随亚油酸接枝比增加而增加,但LMC3/pEGFP与LMC4/pEGFP纳米复合物的细胞核质粒分布百分率无显著差异。4 LMC/pEGFP纳米复合物的体内外转染效率考察LMC/pEGFP纳米复合物转染HEK293细胞的效率,并研究质量比、血清和转染时间对转染效率的影响。结果表明LMC3/pEGFP纳米复合物转染效率最高,质量比为12:1时达34.5%,较壳聚糖/pEGFP纳米复合物高8.0倍;LMC3/pEGFP纳米复合物血清相容性良好,在含血清培养基中转染效率显著增加;转染效率随转染时间延长而增加,72 h时为40.8%,分别为24 h和48 h的2.1和1.4倍。小鼠胫前肌注射LMC3/pEGFP纳米复合物测定其体内转染效率,结果表明LMC3/pEGFP纳米复合物绿色荧光蛋白表达量最高(36.6±10.7 I/mg),分别为聚乙烯亚胺(PEI)/pEGFP纳米复合物和壳聚糖/pEGFP纳米复合物的2.2倍和4.2倍。

全文目录


摘要  5-7
Abstract  7-10
前言  10-13
1 材料和仪器  13-15
2 实验方法  15-25
  2.1 LMC聚合物的制备  15-17
  2.2 LMC纳米粒的制备和表征  17-18
  2.3 pEGFP质粒的制备  18
  2.4 LMC/pEGFP纳米复合物的制备  18
  2.5 LMC/pEGFP纳米复合物的粒径和Zeta电势  18
  2.6 透射电镜  18
  2.7 凝胶阻滞  18-19
  2.8 包封率测定  19
  2.9 核酶抑制  19
  2.10 非特异性蛋白吸附  19-20
  2.11 血红细胞黏附  20-21
  2.12 细胞摄取  21
  2.13 细胞摄取机制  21-22
  2.14 EB排阻  22
  2.15 pEGFP释放  22
  2.16 亚细胞分布  22-23
  2.17 体外细胞转染  23
  2.18 体内转染  23-25
3 结果与讨论  25-49
  3.1 LMC纳米粒  25-27
  3.2 LMC/pEGFP纳米复合物的制备和表征  27-28
  3.3 透射电镜  28-29
  3.4 凝胶阻滞  29
  3.5 包封率  29-30
  3.6 核酶抑制  30-32
  3.7 非特异性蛋白吸附  32-33
  3.8 细胞黏附  33-35
  3.9 细胞摄取  35-36
  3.10 细胞摄取机制  36-37
  3.11 EB排阻  37-38
  3.12 pEGFP释放  38-39
  3.13 核质分布  39-42
  3.14 体外转染  42-45
  3.15 体内转染  45-49
总结与展望  49-51
参考文献  51-56
致谢  56-57
个人简历  57-58
综述 壳聚糖类基因非病毒载体  58-71
  参考文献  64-71

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中图分类: > 医药、卫生 > 临床医学 > 治疗学
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