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棉花纤维细胞起始期相关miRNA的鉴定与功能研究

作　者: 王正明
导　师: 刘进元
学　校: 清华大学
专　业: 生物学
关键词: miRNA 棉花纤维起始 GhmiR156 花青素
分类号: S562
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

棉花是重要的经济作物，为人类提供大量的纤维、蛋白以及油脂。棉花纤维的形态建成经历起始期、伸长期、次生壁合成期、成熟期四个阶段，起始作为纤维发育的第一步，很大程度上决定了纤维最终的数量。miRNA作为一类重要的调控分子，调控植物生长发育、以及应答胁迫等许多重要的生物学过程，推测其在棉花纤维发育中可能也起到重要的作用。棉花miRNA在纤维细胞起始中所发挥的功能还没有报道，因此，本研究以陆地棉徐州142野生型及其无纤维突变体的胚珠组织为材料，采用高通量测序法，分析小RNA文库，旨在筛选与鉴定相关与纤维起始的miRNA，进而分析这些miRNA在纤维细胞起始过程中的作用。从构建的陆地棉徐州142野生型和突变体两个小RNA库中，高通量测序总共获得可分析的序列数分别为5896335和3747020。我们从中鉴定到41个保守的miRNA家族，和36个新的miRNA家族。通过对两个小RNA库中miRNA测序数进行统计分析，共鉴定出31个野生型和突变体差异表达的miRNA。通过Northern杂交检测了其中13个差异表达miRNA在纤维起始期胚珠中的表达模式，利用5’RACE验证了其中5个miRNA的靶标，并用实时定量PCR的方法检测了7个miRNA靶标或预测靶标在起始期胚珠中的表达，发现大部分靶标表达与对应的miRNA呈现负相关，暗示这些miRNA很可能是通过调控这些靶标在纤维细胞起始中发挥作用，从而构建了一个与纤维起始相关miRNA的调控网络。为了进一步理解GhmiR156在纤维早期发育中的作用，我们利用高通量测序分析了其在伸长期纤维中的表达，结果显示，GhmiR156的丰度至开花后20天达到峰值。靶标GhSPL9的表达与GhmiR156完全呈负相关，拟南芥中AtSPL9通过负向调控花青素合成相关基因DFR、F3H、ANS的表达抑制花青素的合成，而棉花DFR、F3H、ANS的同源基因在伸长期纤维中的表达模式与GhSPL9十分类似，暗示了在纤维中GhSPL9可能正向调控这三个基因的表达。我们克隆了DFR和F3H基因的启动子，凝胶滞留实验结果显示，GhSPL9重组蛋白能够与上述基因的启动子结合，并且在烟草瞬时表达实验中，GhSPL9能够显著激活上述启动子驱动的报告基因的转录。另一方面，伸长期纤维中花青素的含量变化也与GhSPL9的表达模式相一致。以上实验表明，GhmiR156在伸长期的纤维中通过抑制GhSPL9的表达，间接抑制了DFR、F3H、ANS的表达，最终抑制花青素的合成，导致开花后20天纤维中花青素的含量达到最低，可能促成H2O2迸发，形成纤维伸长终止的信号。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-11
第1章引言  11-25
  1.1 植物 miRNA 研究进展  11-14
    1.1.1 miRNA 的发现  11
    1.1.2 植物 miRNA 的形成过程及作用机制  11-13
    1.1.3 植物 miRNA 的生理功能  13-14
  1.2 棉花纤维的形态建成  14-17
    1.2.1 纤维起始期  15-16
    1.2.2 纤维快速伸长期  16
    1.2.3 次生壁增厚期  16-17
    1.2.4 成熟期  17
  1.3 纤维细胞早期发育的分子基础  17-22
    1.3.1 纤维早期发育相关基因的研究进展  17-19
    1.3.2 激素对纤维早期发育的影响  19-20
    1.3.3 纤维早期发育的组学研究  20-22
  1.4 棉花 miRNA 的研究进展  22-23
  1.5 问题的提出及本研究的目的  23-25
第2章棉花纤维细胞起始期相关 miRNA 的分离与鉴定  25-71
  2.1 本章引论  25
  2.2 材料与方法  25-33
    2.2.1 植物材料  25-26
    2.2.2 试剂与仪器  26
    2.2.3 RNA 的提取及质量控制  26-27
    2.2.4 小 RNA 文库的构建及 Solexa 测序  27
    2.2.5 测序数据分析  27-29
    2.2.6 miRNA Northern 杂交  29-30
    2.2.7 miRNA 靶基因预测及验证  30-32
    2.2.8 靶基因表达量分析  32-33
  2.3 结果与分析  33-69
    2.3.1 RNA 的提取与文库构建  33-34
    2.3.2 测序数据总体评估  34-38
    2.3.3 保守的 miRNA  38-51
    2.3.4 新鉴定的 miRNA  51-60
    2.3.5 相关于纤维起始的 miRNA  60-68
    2.3.6 棉花胚珠中 miRNA 参与纤维起始的可能作用模型  68-69
  2.4 本章小结  69-71
第3章棉花纤维细胞早期发育中 GhmiR156 的功能分析  71-89
  3.1 本章引论  71-72
  3.2 材料与方法  72-78
    3.2.1 植物材料  72
    3.2.2 质粒与载体构建  72-74
    3.2.3 试剂与仪器  74
    3.2.4 高通量测序及分析  74
    3.2.5 实时定量 PCR  74
    3.2.6 蛋白原核表达与纯化  74-76
    3.2.7 启动子克隆  76-77
    3.2.8 凝胶滞留实验  77
    3.2.9 烟草叶片的瞬时表达实验  77-78
    3.2.10 花青素含量测定  78
  3.3 结果与分析  78-87
    3.3.1 GhmiR156 在起始期和伸长期的表达变化  78-79
    3.3.2 靶标 GhSPL9 及其可能的下游基因在伸长期纤维中的表达变化  79-81
    3.3.3 伸长期纤维中花青素的含量  81-82
    3.3.4 GhDFR 和 GhF3H 基因启动子的克隆  82-84
    3.3.5 GhSPL9 与 GhDFR 和 GhF3H 基因启动子的结合活性分析  84-86
    3.3.6 GhSPL9 对 GhDFR 和 GhF3H 基因的转录激活活性分析  86-87
  3.4 本章小结  87-89
第4章结论与讨论  89-93
  4.1 讨论  89-91
    4.1.1 棉花新 miRNA 的鉴定  89
    4.1.2 GhmiR156 在纤维早期发育中的作用  89-91
    4.1.3 下一步的工作展望  91
  4.2 结论  91-93
参考文献  93-102
致谢  102-104
个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果  104

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