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苯脲类除草剂敌草隆酶联免疫检测方法的研究

作　者: 刘恩梅
导　师: 王硕
学　校: 天津科技大学
专　业: 营养与食品卫生学
关键词: 敌草隆抗体酶联免疫吸附检测法(ELISA) 检测水样
分类号: S481.8
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

针对目前苯脲类除草剂残留问题,本论文开展了对敌草隆农药的酶联免疫分析技术的研究。内容主要包括敌草隆人工抗原合成、多克隆抗体制备、相应的ELISA检测方法的建立、高效液相色谱法(HPLC)验证和实际水样检测。本研究制备了两种带有不同间隔臂长的敌草隆半抗原Hapten4C和Hapten6C。以N-甲基吡咯环酮为反应起始原料,水解制得中间产物N-甲基丁酸,然后与3,4-二氯苯异氰酸酯反应得半抗原Hapten4C1-(3-丙基羧基)-3-(3,4-二氯苯基)-1-甲基脲；以N-甲基己内酰胺为反应起始原料,水解制得中间产物N-甲基已酸,然后与3,4-二氯苯异氰酸酯反应,制得另一半抗原Hapten6C1-(5-戊基羧基)-3-(3,4-二氯苯基)-1-甲基脲。最后采用活化酯法将两种半抗原分别与KLH、BSA偶联制备了免疫原,与OVA、 BSA偶联制备了包被原,与HRP偶联制备了酶标抗原。用四种免疫原Hapten4C-KLH、Hapten6C-KLH、Hapten4C-BSA和Hapten6C-BSA分别免疫八只新西兰大耳白兔,采用背部皮下多点和肌肉注射法经过六次免疫制得敌草隆抗血清,效价在10,000-100,000之间。最佳抗血清是由Hapten4C-KLH免疫的兔编号为No.1产生,对100μg/L敌草隆标准品的抑制率高达85.5%。抗血清经Protein A-Sepharose4B作亲合层析介质纯化得到浓度为3.0mg/mL的敌草隆抗体。经优化,选择Hapten6C-OVA作为包被原,包被量为0.01μg/孔,抗体稀释比例为1：3000,封闭液为0.05%脱脂乳粉,PBS缓冲溶液pH7.4,建立敌草隆间接竞争酶联免疫法(icELISA)。该方法灵敏度(抑制中浓度)为IC50=0.48±0.09μg/L,最低检出限为IC15=0.038±0.007μg/L。然后选定抗体包被量0.25μg/孔,酶标抗原稀释比例为1：10000,封闭液为1%BSA, PBS缓冲溶液pH7.4条件下建立敌草隆直接竞争酶联免疫法(dcELISA).方法灵敏度为IC50=0.20±0.09μg/L,检出限为1C15=0.015±0.007μg/L。该抗体与其它12种苯脲类除草剂中的5种的交叉反应率较高,可用于苯脲类除草剂这一类物质的检测。对采白天津本地的娃哈哈纯净水、自来水和池塘水三种来源的阴性水样进行添加回收实验,用建立的dcELISA方法检测,回收率为89.04%-112.03%,变异系数小于10%。建立的dcELISA经高效液相色谱法(HPLC)验证一致性良好,证明了建立的敌草隆直接竞争ELISA检测结果的准确性,并且稳定可靠。最后用本研究建立的dcELISA法分析采集于澳大利亚的各种地表水,包括河水、泉水和废水。17个水样中有14个阳性样,含量为0.07-3.10μg/L。所有水样经dcELISA检测后,直接添加2μg/L的敌草隆标准品,回收率为96.6-129.1%。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-9
1 前言  9-25
  1.1 农药概述  9-13
    1.1.1 农药残留现状  9-10
    1.1.2 农药残留的危害  10-12
    1.1.3 农药残留的控制措施  12-13
  1.2 免疫分析技术概述  13-18
    1.2.1 基本理论  13-14
    1.2.2 免疫分析技术中的标记技术  14-15
    1.2.3 免疫分析技术在农药研究领域中的应用  15-16
    1.2.4 农药免疫分析技术的程序  16-18
  1.3 敌草隆残留检测及研究进展  18-24
    1.3.1 敌草隆概述  18-20
    1.3.2 敌草隆的残留限量  20
    1.3.3 敌草隆残留检测方法  20-24
  1.4 论文研究的目的及意义  24
  1.5 研究内容  24-25
2 材料与方法  25-38
  2.1 实验材料  25-27
    2.1.1 药品  25-26
    2.1.2 试剂  26
    2.1.3 仪器及设备  26-27
    2.1.4 样品  27
    2.1.5 常用溶液的配制  27
  2.2 实验方法  27-38
    2.2.1 敌草隆半抗原的制备  28-29
    2.2.2 活化酯的制备  29-30
    2.2.3 免疫原的制备  30
    2.2.4 包被原的制备  30
    2.2.5 酶标抗原的制备  30-31
    2.2.6 敌草隆多克隆抗体制备  31-32
    2.2.7 间接竞争酶联免疫检测方法(Indirect competition ELISA,icELISA)的建立  32-33
    2.2.8 直接竞争酶联免疫检测方法(Direct competition ELISA,dcELISA)的建立  33-35
    2.2.9 水样处理方法  35
    2.2.10 敌草隆dcELISA检测方法性能指标的评价  35-36
    2.2.11 仪器分析法确证  36
    2.2.12 实际水样检测  36-38
3 结果与讨论  38-60
  3.1 敌草隆半抗原的合成  38-42
    3.1.1 半抗原Hapten 4C的结构鉴定  38-39
    3.1.2 半抗原Hapten 6C的结构鉴定  39-40
    3.1.3 Hapten 4C活化酯的结构鉴定  40-41
    3.1.4 Hapten 6C活化酯的结构鉴定  41-42
  3.2 敌草隆抗体的制备  42-43
    3.2.1 抗血清效价与亲和力的测定  42
    3.2.2 敌草隆抗体的纯化  42-43
  3.3 间接竞争酶联免疫法(icELISA)检测法的建立  43-47
    3.3.1 包被原的选择  43
    3.3.2 包被量和抗体浓度的优化  43-44
    3.3.3 缓冲溶液PBS的pH值对icELISA反应体系的影响  44-45
    3.3.4 封闭液对icELISA反应体系的影响  45-46
    3.3.5 icELISA检测方法标准曲线的绘制  46-47
  3.4 直接竞争酶联免疫法(dcELISA)检测法的建立  47-51
    3.4.1 抗体包被量和酶标抗原浓度的优化  47-48
    3.4.2 缓冲溶液PBS的pH值对dcELISA反应体系的影响  48
    3.4.3 封闭液对dcELISA反应体系的影响  48-49
    3.4.4 dcELISA检测方法标准曲线的绘制  49-50
    3.4.5 特异性  50-51
  3.5 直接竞争ELISA检测方法性能指标的评价  51-55
    3.5.1 检测限  51
    3.5.2 准确度  51-52
    3.5.3 精密度  52-53
    3.5.4 酶标抗原稳定性的测试  53-54
    3.5.5 温度对抗体稳定性的影响  54-55
  3.6 液相色谱法验证dcELISA方法的有效性  55-58
    3.6.1 液相色谱检测敌草隆  55-56
    3.6.2 高效液相色谱法验证  56-58
  3.7 实际样品检测  58-60
4 结论  60-61
5 展望  61-62
6 参考文献  62-70
7 研究生期间发表论文情况  70-71
8 致谢  71

苯脲类除草剂敌草隆酶联免疫检测方法的研究

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