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球孢白僵菌的繁殖与自然群体交配型关系的研究

作　者: 蔡悦
导　师: 黄勃
学　校: 安徽农业大学
专　业: 森林保护学
关键词: 球孢白僵菌 交配型 有性型 无性型 系统发育种 SSR
分类号: S763.306.4
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


球孢白僵菌是最广泛和最重要的虫生真菌，在持续控制害虫和维护生态平衡方面具不可替代的作用，故倍受国内外生物防治界的关注。由于球孢白僵菌以无性繁殖为主导的生殖方式和我们关于其有性型的发现，引发了其无性型流行的原因和有性型在自然界发生的分子机理的问题。本研究通过PCR-DGGE技术结合Bloc和TEF位点序列分析，对国内各有性型、无性型发生地的球孢白僵菌系统发育种进行鉴定，通过交配型基因（Mat）的扩增和SSR分子标记，对这些种群的交配型类型和基因流做深入分析，拟揭示球孢白僵菌有性型发生和无性型流行与自然种群交配型之间的关系，进一步分析不同的球孢白僵菌系统发育种存在有性型的可能性，最终为阐明该菌有性型发生及无性型流行的分子机理提供理论依据。主要结果如下：1、基于Bloc和TEF位点的序列，分别对国内6个地区共582株球孢白僵菌进行了系统发育分析。结果表明，随着地理位置和环境条件的不同，球孢白僵菌系统发育种在各地区的分布有很大差异。各地区系统发育种的数量由多到少依次顺序是鼎湖山（4）＞漫水河和牯牛降（3）＞宽阔水和琅琊山（2）＞净月潭（1）。综合来看，这些菌株可划分为5个不同的系统发育种，分别是Europe/N. Africa1（271株），AFNEO1（27株），Asia3（60株），Asia4（212株）和N. America2（12株）。其中Asia4在6个地区均有分布，菌株数量占总数的36.4%，仅次于Europe/N. Africa1，表明该系统种在国内的分布区域很广。46.6%的菌株属于有性发生系统Europe/N.Africa1，在牯牛降、漫水河、琅琊山、宽阔水地区发现，这4个地区该系统种的菌株数量分别为120、61、60和30株。5%的菌株属于AFNEO1，只在牯牛降和鼎湖山地区发现，分别为4和23株。其寄主范围相对较窄，多数侵染鞘翅目昆虫，暗示着菌株和寄主间可能存在潜在的关联。10%的菌株属于Asia3，只在漫水河和鼎湖山地区发现，分别为23和37株。该系统种全部由中国不同地区的菌株构成，为中国特有系统种。仅有2%的菌株属于于N.America2，仅在鼎湖山地区发现，而且均分离自土壤。2、对6个地区球孢白僵菌菌株交配型数量和比例进行了研究。582株球孢白僵菌菌株中存在两种交配型，MAT1或MAT2，不存在含有两种交配型基因的菌株，这些菌株的交配模式是异宗配合。从系统发育种的水平上看，大部分地区球孢白僵菌系统种内的交配型都不缺失（除净月潭）。有性型发生系统种Europe/N.Africa1的交配型比例都较均匀，分别为51:69（牯牛降）、37:24（漫水河）、39:21（琅琊山）、15:15（宽阔水），在净月潭和鼎湖山没有发现此系统种。不仅Europe/N. Africa1的交配型比例较均衡（142:129），但大部分无性系统种内的交配型比例也并不悬殊。AFNEO1、Asia3和Asia4内的比值分别为11:16，33:27和125:87。鼎湖山地区的N. America2交配型比例不均衡（10:2）。就某一地区而言，有些系统种的交配型比例是不均衡的，如：Asia4在净月潭和鼎湖山的比例分别为39:1和2:7。因此在球孢白僵菌有性型产生的过程中交配型比例均匀只是必要条件，而不是充分条件。3、对6个地区球孢白僵菌群体的遗传多样性进行了初步调查。结果显示各地区球孢白僵菌种群Nei’s基因多样性指数（h）和Shannon信息指数（Is）由大到小依次为琅琊山（h=0.290，Is=0.449）＞净月潭（h=0.260，Is=0.402）＞漫水河（h=0.226，Is=0.361）＞鼎湖山（h=0.213，Is=0.349）＞宽阔水（h=0.175，Is=0.294）＞牯牛降（h=0.165，Is=0.271）。从有性系统种和其他系统种的遗传多样性比较来看，各地区Europe/N. Africa1系统种的遗传多样性水平往往不是最高的。可能的原因是在采集样品的过程中，取样过于集中于球孢虫草发生的核心区域，生态环境差异小，因此造成了种群的遗传多样性较低。4、研究了5个地区球孢白僵菌系统发育种间的基因流和遗传分化。从数据来看，存在有性型系统种的4个地区各系统发育种间的基因交流明显。其中宽阔水地区基因流最大（Nm=6.8987），而琅琊山最小（Nm=1.2126）。琅琊山地区（Gst=0.1709）各系统发育种间表现为高度分化，牯牛降（Gst=0.1447）和漫水河地区（Gst=0.0889）表现为中度分化，宽阔水地区（Gst=0.0350）各群体间则不存在分化。而鼎湖山地区各系统发育种的基因分化系数值（Gst=0.3157）超过了Wright重度分化阈值0.25，其中N. America产生的遗传分化很明显，可能是一个不同的生物种。5、综合分析发现，牯牛降和漫水河地区确实存在球孢虫草发生的必要条件，而宽阔水和琅琊山地区的球孢虫草资源有待进一步调查。依据Europe/N.Africa1系统种的交配型比例和遗传多样性指标，各地有性型产生的可能性由高到低次序为琅琊山＞牯牛降＞宽阔水＞漫水河。净月潭的系统种Asia4内MAT1/2=39:1，互补交配型的缺失会限制有性重组发生。鼎湖山发现的4个系统种均为无性系统种，因此无有性生殖。以上研究明确了存在有性系统发育种和交配型比例均匀是发生有性型的必要条件。6、基于核基因间区Bloc位点对中国不同地区的189株白僵菌进行了物种多样性分析，发现国内存在6个白僵菌种。分别为B. bassiana, B. brongniartii, B.australis, B. asiatica, B. pseudobassiana和B. caledonica。其中B. australis为国内新纪录种。这是首次对中国白僵菌属做出系统的分类研究。证明通过Bloc位点的引入，可以对白僵菌属内菌株进行准确鉴定。

全文目录


摘要  3-5
Abstract  5-11
第一章 文献综述  11-23
  1.1 真菌的分子系统学研究概述  11-14
  1.2 白僵菌属的分类学和系统演化  14-16
  1.3 基于PCR的分子标记  16-18
  1.4 白僵菌的繁殖方式  18-20
  1.5 选题的目的与意义  20-23
第二章 引言  23-25
第三章 牯牛降球孢白僵菌的繁殖与自然群体交配型的关系  25-50
  3.1 实验材料及其来源  25-33
    3.1.1 供试菌株  25
    3.1.2 主要培养基  25
    3.1.3 主要化学试剂  25-30
    3.1.4 主要试剂配制  30-32
    3.1.5 主要仪器设备  32-33
  3.2 实验方法  33-41
    3.2.1 菌株鉴定  33
    3.2.2 菌丝体制备  33
    3.2.3 DNA提取与纯化  33
    3.2.4 DNA浓度和质量检测  33-34
    3.2.5 交配型基因（MAT）扩增反应  34-35
    3.2.6 核基因间区（Bloc）扩增反应  35-36
    3.2.7 Bloc-DGGE电泳  36-37
    3.2.8 不同带型菌株的Bloc及TEF测序  37-38
    3.2.9 序列数据分析及系统进化树构建  38
    3.2.10 各系统发育种的交配型比例  38
    3.2.11 SSR-PCR反应条件及程序  38-39
    3.2.12 SSR-PCR产物测序胶电泳  39-40
    3.2.13 SSR电泳图谱统计计算  40-41
  3.3 结果与分析  41-48
    3.3.1 供试菌株DNA质量检测  41
    3.3.2 交配型基因（Mat）扩增结果  41-42
    3.3.3 Bloc-DGGE电泳  42-46
    3.3.4 微卫星引物扩增产物电泳分析  46-48
  3.4 讨论  48-50
第四章 漫水河球孢白僵菌的繁殖与自然群体交配型的关系  50-60
  4.1 实验材料及其来源  50
  4.2 实验方法  50
  4.3 结果与分析  50-57
    4.3.1 供试菌株DNA质量检测  50
    4.3.2 交配型基因（Mat）扩增结果  50-54
    4.3.3 Bloc-DGGE电泳  54-56
    4.3.4 微卫星引物扩增产物电泳分析  56-57
  4.4 讨论  57-60
第五章 琅琊山球孢白僵菌的繁殖与自然群体交配型的关系  60-69
  5.1 实验材料及其来源  60
  5.2 实验方法  60
  5.3 结果与分析  60-66
    5.3.1 供试菌株DNA质量检测  60
    5.3.2 交配型基因（Mat）扩增结果  60-63
    5.3.3 Bloc-DGGE电泳  63-64
    5.3.4 微卫星引物扩增产物电泳分析  64-66
  5.4 讨论  66-69
第六章 净月潭球孢白僵菌的繁殖与自然群体交配型的关系  69-76
  6.1 实验材料及其来源  69
  6.2 实验方法  69
  6.3 结果与分析  69-74
    6.3.1 供试菌株DNA质量检测  69
    6.3.2 交配型基因（Mat）扩增结果  69-71
    6.3.3 Bloc-DGGE电泳  71-73
    6.3.4 微卫星引物扩增产物电泳分析  73-74
  6.4 讨论  74-76
第七章 鼎湖山球孢白僵菌的繁殖与自然群体交配型的关系  76-85
  7.1 实验材料及其来源  76
  7.2 实验方法  76
  7.3 结果与分析  76-83
    7.3.1 供试菌株DNA质量检测  76
    7.3.2 交配型基因（Mat）扩增结果  76-79
    7.3.3 Bloc-DGGE电泳  79-81
    7.3.4 微卫星引物扩增产物电泳分析  81-83
  7.4 讨论  83-85
第八章 宽阔水球孢白僵菌的繁殖与自然群体交配型的关系  85-93
  8.1 实验材料及其来源  85
  8.2 实验方法  85
  8.3 结果与分析  85-91
    8.3.1 供试菌株DNA质量检测  85
    8.3.2 交配型基因（Mat）扩增结果  85-88
    8.3.3 Bloc-DGGE电泳  88-89
    8.3.4 微卫星引物扩增产物电泳分析  89-91
  8.4 讨论  91-93
第九章 中国白僵菌菌株的物种多样性研究  93-107
  9.1 材料与方法  94-100
    9.1.1 供试菌株和DNA提取  94
    9.1.2 DGGE分析  94
    9.1.3 PCR扩增及产物测序  94
    9.1.4 序列比对和分析  94-100
  9.2 结果  100-102
    9.2.1 DGGE扫描  100
    9.2.2 白僵菌属的系统发育分析  100-102
  9.3 讨论  102-107
第十章 总结  107-112
  10.1 各地区球孢白僵菌系统发育种的分布  107-109
  10.2 各地区球孢白僵菌系统发育种的交配型比例  109-110
  10.3 各地区球孢白僵菌系统发育种的遗传多样性  110-112
    10.3.1 各地区球孢白僵菌系统发育种的遗传多样性分析  110
    10.3.2 各地区球孢白僵菌系统发育种间的基因流分析  110-112
第十一章 结论与创新点  112-114
  11.1 结论  112-113
  11.2 创新点  113-114
参考文献  114-123
致谢  123-124
作者简介  124
攻读博士期间发表的学术论文  124

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中图分类: > 农业科学 > 林业 > 森林保护学 > 森林病虫害及其防治 > 虫害及其防治 > 一般性问题 > 防治方法 > 生物防治
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