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安全型高色价红曲色素生产工艺研究

作　者: 陈奇
导　师: 王伟平
学　校: 湖北工业大学
专　业: 发酵工程
关键词: 红曲红曲色素桔霉素液态发酵固态发酵
分类号: TS264.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

红曲色素是红曲霉的次级代谢产物，一直以来被认为是安全性较高的食用色素，试验已证明不含黄曲霉毒素，也无致突变作用。随着1995年法国学者P.J.Blanc等在红曲菌发酵产物中检测到一种对人畜有害的真菌毒素——桔霉素(Citrinin)，红曲色素作为食品添加剂的安全问题受到了人们的关注。本文首先通过摇瓶液态发酵从实验室保藏菌株中筛选出菌株Monascus.sp.H4，作为本课题的出发菌株进行紫外诱变，得到一株高产色素低产桔霉素的菌株Monascus.sp.HS4000，通过单因素与正交实验方法优化了Monascus.sp.HS4000的固态发酵工艺；通过响应面实验优化了Monascus.sp.HS4000液态摇瓶发酵条件，并利用10L发酵罐进行了放大实验。本论文包括以下方面内容：（1）利用摇瓶液态发酵，从H1、H2、H3、H4、H5、H6六株红曲霉菌株中筛选出H4作为诱变的出发菌株。采用紫外诱变对Monascus.sp.H4菌株进行诱变处理，筛选出Monascus.sp.HS4000为生产菌株，其液态摇瓶发酵6天，色素含量为42.3U/ml,桔霉素含量为0.36mg/L。（2）对红曲米中桔霉素的快速检测方法进行了研究，得到了一种能快速、安全、有效的检测出红曲米中桔霉素的方法——滤纸片抑菌圈法。优化了红曲米中桔霉素的萃取方法，最佳方法为68%乙醇摇床振摇加超声辅助提取法。（3）在三角瓶培养中，利用单因素实验方法对培养温度、接种量、培养基装量、转速等因素进行了研究，然后利用响应面实验方法对红曲液态发酵培养条件进一步优化，得到的工艺为：接种量为10%、培养基装量为70ml、转速为230rpm。在该条件下色素含量为114.06U/ml，桔霉素含量为0.503mg/L，利用单因素实验方法考察了维生素H对红曲液态发酵的影响，得到维生素H最佳添加量为20μg/L。（4）根据摇瓶培养得到的条件，再用10L发酵罐进行小试实验，得到了三阶段通风控制的工艺条件。此条件为前24h通风为200L/h；24h～60h通风为300L/h；60h后通风调整为100L/h，维生素H添加量为20μg/L。此条件下所得色价为199.6U/ml，桔霉素为1.08mg/L。与优化前相比色素变化不大，而桔霉素下降54.7%。（5）对固态发酵中影响红曲产色素和桔霉素的条件进行了单因素研究，并选取培养基装量、培养温度、接种量、第一次翻曲时间四个因素进行了正交实验，得到了一个较好的工艺条件。该工艺为：接种量8%、培养温度32℃、第一次翻曲时间24h，最佳维生素H添加量为40μg/Kg，此时色价为3500u/kg，桔霉素含量为0.89mg/L。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-8
目录  8-13
第1章绪论  13-21
  1.1 红曲霉简介  13
  1.2 红曲色素  13-14
    1.2.1 红曲色素的种类  13-14
    1.2.2 红曲色素的合成途径  14
    1.2.3 红曲色素应用存在的安全性问题  14
  1.3 红曲中的桔霉素  14-17
    1.3.1 桔霉素的抑菌性  15
    1.3.2 桔霉素的合成途径  15-16
    1.3.3 桔霉素的分析方法  16-17
      1.3.3.1 高效液相色谱法及存在的问题  16-17
      1.3.3.2 抑菌圈法及存在的问题  17
  1.4 红曲色素研究现状  17-19
    1.4.1 优良菌株的选育  17-18
    1.4.2 固态发酵生产红曲色素工艺的优化  18-19
    1.4.3 液态发酵生产红曲色素工艺的优化  19
  1.5 本课题研究意义及内容  19-21
第2章出发菌株的筛选与诱变  21-27
  2.1 引言  21
  2.2 实验材料  21-22
    2.2.1 菌种  21
    2.2.2 培养基  21
    2.2.3 主要试剂  21-22
    2.2.4 主要仪器  22
  2.3 实验方法  22-24
    2.3.1 菌种活化  22
    2.3.2 出发菌株的筛选  22-23
    2.3.3 出发菌株的诱变  23
    2.3.4 色价的测定方法  23
    2.3.5 桔霉素的测定方法  23-24
  2.4 结果与分析  24-26
    2.4.1 出发菌株的筛选结果  24
    2.4.2 诱变剂量的确定  24-25
    2.4.3 筛选结果  25-26
  2.5 讨论  26-27
第3章桔霉素检测方法的研究  27-37
  3.1 红曲米中桔霉素萃取方法研究  27-32
    3.1.1 引言  27
    3.1.2 材料  27-28
    3.1.3 方法  28
      3.1.3.1 红曲样品处理方法  28
      3.1.3.2 色谱条件  28
    3.1.4 结果与分析  28-31
      3.1.4.1 不同萃取方法所得 HPLC 图谱对比  28-30
      3.1.4.2 不同萃取方法萃取效率的对比  30-31
      3.1.4.3 68%乙醇振摇加超声辅助萃取方法加样回收结果  31
    3.1.5 讨论  31-32
  3.2 红曲米中桔霉素快速检测方法的研究  32-37
    3.2.1 材料  32
    3.2.2 方法  32-33
    3.2.3 结果与分析  33-36
    3.2.4 讨论  36-37
第4章液态发酵工艺优化  37-46
  4.1 引言  37
  4.2 材料方法  37
    4.2.1 培养基  37
    4.2.2 菌种  37
  4.3 方法  37-39
    4.3.1 二级种子的制备  37-38
    4.3.2 温度对红曲液态发酵的影响  38
    4.3.3 接种量对红曲液态发酵的影响  38
    4.3.4 培养基装量对红曲液态发酵的影响  38
    4.3.5 转速对红曲液态发酵的影响  38
    4.3.6 红曲液态发酵条件的优化  38
    4.3.7 维生素 H 对色素和桔霉素的影响  38-39
  4.4 结果和讨论  39-45
    4.4.1 温度对红曲液态发酵的影响结果  39
    4.4.2 接种量对红曲液态发酵的影响结果  39-40
    4.4.3 装液量对红曲液态发酵的影响结果  40
    4.4.4 转速对红曲液态发酵的影响结果  40-41
    4.4.5 响应面法优化红曲发酵条件结果  41-43
    4.4.6 响应面的分析  43-44
    4.4.7 优化提取参数和验证模型  44-45
    4.4.8 维生素 H 对色素和桔霉素的影响结果  45
  4.5 讨论  45-46
第5章液态发酵放大实验  46-52
  5.1 引言  46
  5.2 材料  46
    5.2.1 培养基  46
    5.2.2 菌种  46
  5.3 方法  46-47
    5.3.1 二级种子的制备  46-47
    5.3.2 10L 发酵罐中不同通气量对色素和桔霉素的影响  47
    5.3.3 10L 发酵罐中搅拌对色素和桔霉素的影响  47
    5.3.4 10L 发酵罐中三阶段通气对色素和桔霉素的影响  47
    5.3.5 10L 发酵罐中添加维生素 H 对色素和桔霉素的影响  47
  5.4 结果与分析  47-51
    5.4.1 发酵罐中不同通气量对色素和桔霉素的影响  47-48
    5.4.2 发酵罐中搅拌对色素和桔霉素的影响  48-49
    5.4.3 发酵罐中三阶段通气对色素和桔霉素的影响  49-50
    5.4.4 发酵罐中三阶段通气添加维生素 H 对色素和桔霉素的影响...  50-51
  5.5 结论  51-52
第6章固态发酵工艺优化  52-64
  6.1 引言  52
  6.2 材料  52-53
    6.2.1 主要试剂  52
    6.2.2 主要仪器  52-53
    6.2.3 培养基  53
    6.2.4 菌种  53
  6.3 方法  53-57
    6.3.1 液体种子培养  53
    6.3.2 最佳接种量的确定  53-54
    6.3.3 最佳发酵温度的确定  54
    6.3.4 第一次翻曲时间的确定  54
    6.3.5 最佳发酵厚度的确定  54
    6.3.6 正交实验  54-55
    6.3.7 初始 pH 的确定  55
    6.3.8 最佳补水 pH 的确定  55-56
    6.3.9 维生素 H 添加量实验  56
    6.3.10 红曲米最佳培养时间实验  56-57
  6.4 结果与分析  57-62
    6.4.1 接种量对红曲米色价和桔霉素的影响  57
    6.4.2 温度对固态发酵产红曲色素、桔霉素的影响  57-58
    6.4.3 第一次翻曲时间对色素和桔霉素的影响  58
    6.4.4 培养基装量对固态发酵产红曲色素、桔霉素的影响  58-59
    6.4.5 红曲培养条件正交实验结果  59-60
    6.4.6 pH 对固态发酵产红曲色素、桔霉素的影响  60-61
      6.4.6.1 初始 pH 对红曲固态发酵产色素和桔霉素的影响  60-61
      6.4.6.2 补水 pH 对红曲固态发酵产色素和桔霉素的影响  61
    6.4.7 维生素 H 对红曲米色价和桔霉素的影响  61-62
    6.4.8 合适的培养时间对红曲产色素和桔霉素的影响  62
  6.5 讨论  62-64
第7章结论与展望  64-66
  7.1 主要结论  64
  7.2 创新点  64-65
  7.3 展望  65-66
参考文献  66-69
致谢  69-70
附录  70

安全型高色价红曲色素生产工艺研究

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