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拟南芥G蛋白α亚基GPAl互作蛋白的筛选与鉴定

作　者: 许鹏博
导　师: 张小红
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 植物学
关键词: 均一化cDNA文库 G蛋白复合体泛素分离系统蛋白质互作铝离子胁迫
分类号: Q946
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

拟南芥G蛋白复合体（异源三聚体包括α、β、γ亚基）参与植物多个信号转导途径，G蛋白复合体通过膜上的G蛋白偶联受体（GPCR）接受胞外信号后通过三个亚基将信号传递给下游效应器。目前，有关植物G蛋白复合体的效应器及其信号传递途径的报道较少，寻找新的G蛋白的效应器有助于阐明G蛋白复合体相关的信号传导途径。本研究以拟南芥为实验材料，提取总RNA构建拟南芥均一化cDNA文库，并以拟南芥G蛋白α亚基GPA1为诱饵蛋白，利用泛素分离系统（hunter系统）筛选cDNA文库，以期获得新的GPA1互作蛋白，为阐明G蛋白参与的信号途径提供理论基础。本研究取得以下实验结果：1、利用SMART技术（switching mechanism at5’-end of RNA transcript）和DSN技术（duplex-specific nuclease）构建了均一化的ABA处理的拟南芥cDNA文库，文库库容为1.079×106。2、利用泛素分离系统筛选文库，共获得100个编码蛋白的基因。经过跨膜预测分析，在候选克隆中，61个蛋白具有1次以上跨膜结构域；26个蛋白具有3次以上跨膜结构域，证明利用泛素分离系统可以有效筛选与GPA1互作的膜蛋白。3、在筛选的候选克隆中获得一个铜离子结合蛋白AtBCB。通过荧光双分子杂交实验（BiFC）证明GPA1与AtBCB在细胞膜上互作。4、基因表达特性分析表明，GPA1和AtBCB受金属铝胁迫的诱导表达。在100μmol/L Al3+处理下，GPA1突变体gpa1-4根部丙二醛含量（丙二醛含量反映细胞受损程度，丙二醛含量高证明细胞受损程度高）显著（P<0.05）低于WT；AtBCB突变体bcb根部丙二醛含量极显著（P<0.01）高于WT，证明GPA1在植物铝胁迫耐受过程中起负向作用，AtBCB起正向作用。5、分析三个铝胁迫响应基因（苹果酸转运体基因AtALMT1、半类型ABC转运蛋白基因ALS1和ABC转运蛋白基因ALS3）在野生型及突变体中的表达情况，结果发现，在有铝和无铝处理情况下，ALS1和ALS3的表达水平在突变体和WT间均无显著差异；在铝处理下，gpa1-4中AtALMT1的表达量极显著高于WT；在bcb中AtALMT1的表达量显著低于WT。综合以上结果表明，采用泛素分离系统筛选cDNA文库获得的100个GPA1候选互作蛋白中，大部分为膜蛋白。其中一个互作蛋白为铜离子结合蛋白AtBCB，经过BiFC实验，突变体表型观察证明GPA1与AtBCB具有相互作用，并调控苹果酸转运体基因AtALMT1的表达，参与植物对铝胁迫的响应，其中，GPA1对铝胁迫耐受起负向作用，AtBCB对铝胁迫耐受起正向作用。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-14
第一章文献综述  14-30
  1.1 异源三聚体-G 蛋白复合体  14-16
    1.1.1 G 蛋白α亚基  14-15
    1.1.2 G 蛋白β亚基  15-16
    1.1.3 G 蛋白γ亚基  16
  1.2 植物 G 蛋白参与多种信号传导过程  16-21
    1.2.1 G 蛋白参与植物的生长及形态发育过程  16-17
    1.2.2 G 蛋白参与激素信号和糖信号的应答反应  17-19
    1.2.3 G 蛋白参与气孔运动和离子通道的调控  19
    1.2.4 G 蛋白参与植物对病原体的防卫作用  19-20
    1.2.5 G 蛋白参与植物的光信号转导  20-21
  1.3 G 蛋白的互作蛋白研究进展  21-23
  1.4 蛋白互作的研究方法  23-28
    1.4.1 经典的酵母双杂系统  24
    1.4.2 酵母三杂交系统  24-25
    1.4.3 反向 Ras 拯救系统  25-26
    1.4.4 以 G 蛋白途径为基础的酵母双杂交系统  26
    1.4.5 泛素分离系统  26-27
    1.4.6 双分子荧光互补（BiFC）及能量共振转移（FRET）  27-28
    1.4.7 Pull-down 和 Co-IP 验证蛋白互作  28
  1.5 本研究的目的意义  28-29
  1.6 技术路线  29-30
第二章拟南芥均一化 cDNA 文库构建  30-40
  2.1 实验材料  30
  2.2 试剂与仪器  30
    2.2.1 试剂  30
    2.2.2 仪器  30
  2.3 实验方法  30-36
    2.3.1 野生型拟南芥总 RNA 提取  30-31
    2.3.2 cDNA 第一链的合成  31-32
    2.3.3 PCR 扩增合成 ds cDNA  32
    2.3.4 ds cDNA 的纯化  32
    2.3.5 ds cDNA 的均一化处理  32-33
    2.3.6 均一化酶的浓度及均一化 cDNA 的 PCR 扩增循环数的优化  33-34
    2.3.7 均一化 cDNA 的 PCR 扩增及纯化  34
    2.3.8 均一化 ds cDNA 的酶切及回收  34-35
    2.3.9 ds cDNA 与载体 pPR3N 的连接  35
    2.3.10 文库质粒的扩增  35
    2.3.11 文库菌体的收集、保存和文库质粒的制备  35-36
  2.4 结果与分析  36-40
    2.4.1 拟南芥总 RNA 提取  36
    2.4.2 ds cDNA 的合成  36-37
    2.4.3 ds cDNA 均一化条件优化  37
    2.4.4 ds cDNA 与 pPR3N 的酶切、连接及转化  37-40
第三章泛素分离系统筛选文库  40-50
  3.1 材料  40
  3.2 试剂与仪器  40
    3.2.1 试剂  40
    3.2.2 仪器  40
  3.3 实验方法  40-44
    3.3.1 诱饵载体 pDHB1-GPA1 的构建  40-42
    3.3.2 诱饵载体的功能验证  42
    3.3.3 诱饵载体 pDHB1-GPA1 筛库条件优化  42-43
    3.3.4 利用泛素分离系统筛选文库  43-44
  3.4 结果与分析  44-50
    3.4.1 诱饵载体构建  44-45
    3.4.2 诱饵载体功能验证  45-46
    3.4.3 诱饵载体筛库条件优化  46-48
    3.4.4 泛素分离系统筛选文库  48-49
    3.4.5 文库质粒的转化效率  49-50
第四章 GPA1 与 AtBCB 的互作验证及功能分析  50-59
  4.1 材料  50
  4.2 试剂与仪器  50
    4.2.1 试剂  50
    4.2.2 仪器  50
  4.3 实验方法  50-52
    4.3.1 泛素分离系统验证 GPA1 与 AtBCB 互作  50-51
    4.3.2 GPA1 和 AtBCB 的亚细胞定位和双分子荧光互补（BiFC）  51
    4.3.3 gpa1-4 和 bcb 纯合突变体鉴定  51
    4.3.4 GPA1 和 AtBCB 的表达分析  51
    4.3.5 铝离子胁迫处理下丙二醛含量测定  51-52
    4.3.6 铝离子胁迫相关基因的表达分析  52
  4.4 结果与分析  52-59
    4.4.1 酵母双杂交  52-53
    4.4.2 GPA1 与 ATBCB 的亚细胞定位及双分子荧光互补  53-54
    4.4.3 纯合突变体的鉴定  54-55
    4.4.4 铝胁迫下 GPA1 和 AtBCB 的表达分析  55-56
    4.4.5 铝离子胁迫下膜脂过氧化程度  56-57
    4.4.6 铝离子胁迫下相关基因表达变化  57-59
第五章讨论与结论  59-62
  5.1 讨论  59-61
    5.1.1 cDNA 文库构建  59
    5.1.2 泛素分离系统有利于发现新的 GPA1 的互作蛋白  59-60
    5.1.3 GPA1 和 AtBCB 参与拟南芥对铝胁迫的应答反应  60-61
  5.2 结论  61-62
参考文献  62-72
附录 1  72-73
附录 2  73-74
缩略词  74-75
致谢  75-76
个人简介  76

拟南芥G蛋白α亚基GPAl互作蛋白的筛选与鉴定

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