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拟南芥蛋白质的互作机制及桑树同源基因功能的研究

作　者: 沈国新
导　师: 楼程富
学　校: 浙江大学
专　业: 特种经济动物饲养
关键词: 拟南芥 桑树 AtCHIP 蛋白质互作 叶绿体蛋白酶 ClpP4和FtSH1 基因功能
分类号: Q943.2
类　型: 博士论文
年　份: 2005年
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内容摘要


植物学的研究已进入后基因组时代。基因组测序计划鉴定出大量的有待明确其功能的基因。一项研究蛋白质互作作图的重要技术是酵母双杂系统。这项技术的应用,需要一系列酵母菌及大肠杆菌转化,而后在营养缺陷型培养基上筛选阳性克隆。该技术1989年问世,在短短的10余年时间内,已成了研究蛋白质互作的重要手段,并揭示了生命体内大量的蛋白质互作关系。 拟南芥基因AtCHIP是一个与动物(人类、老鼠)基因CHIP有相似结构、功能和非常高的碱基同源性的植物基因,被证明是E3结合蛋白酶,参与泛素-蛋白酶体系的蛋白质降解作用。AtCHIP表现出与植物逆境胁迫如高温、低温、高盐的应答有关。为进一步探索AtCHIP的功能及其机理。本文以AtCHIP为研究对象,利用酵母双杂系统,从拟南芥cDNA文库中筛选与之有相互作用的蛋白质,从而进一步研究了其互作基因的功能。研究得到了以下主要结果。 1.利用酵母双杂技术,筛选得到了1036个与AtCHIP有互作的候选克隆,经营养缺陷型培养基筛选,共获得了111个阳性克隆,对质粒DNA进行了测序,测序结果提交拟南芥genebank分析,有29种蛋白与AtCHIP有相互作用(同源性达98%以上),有12种基因序列未在genebank中找到同源序列,可能为新的拟南芥基因。AtCHIP互作蛋白中重复频率最高的有UBC家属酶蛋白,Htransporting ATP synthesizing chain 9,叶绿体蛋白酶等。 2.证实了AtCHIP与缀合酶E2及泛素分子有专一性的互作关系。在已经被证实的40种拟南芥缀合酶E2中,UBC8、UBC9和UBC10 3种与AtCHIP有互作关系;同样,在已发现的15种泛素分子中,UBQ1、UBQ5二种与AtCHIP有互作关系。证明AtCHIP的这种互作关系是一种特导性的反应。 3.生物体外试验证实叶绿体蛋白酶Clpe4,FtSH1是以AtCHIP为E3的泛素-蛋白酶体系的底物。首先,利用PET系统,成功地表达了AtCHIP,UBC8,ClpP4等3个基因的蛋白质,并加以提纯。以此为材料进行了泛素化体外反应试验,以AtCHIP为E3,UBC8为E2,ClpP4为底物的体外反应试验结果表明,至少有3个泛素分子被结合到ClpP4分子上。 4.生物体内分子生物学检测(Western Blot)也证实ClpP4,FtSH1是AtCHIP

全文目录


致谢  9-10
中文摘要  10-12
前言  12-13
第一部分 文献综述  13-38
  第一章 蛋白质组的研究与酵母双杂交技术  13-18
    1.蛋白质组的研究  13-16
      1.1 蛋白质组学研究的主要领域  13-15
      1.2 蛋白质组学研究技术  15-16
    2.酵母双杂技术综述  16-18
      2.1 酵母双杂技术  16
      2.2 酵母双杂技术在蛋白质互作研究中的应用  16-17
      2.3 酵母双杂技术所用的主要质粒与菌种  17-18
  第二章 分子生物学研究的模式植物拟南芥及若干基因的研究现状  18-26
    1.拟南芥的研究现状  18-21
      1.1 研究历史  18-19
      1.2 研究现状  19-20
      1.3 拟南芥中与逆境(温度、水分、盐分)有关基因研究现状  20-21
    2.拟南芥基因AtCHIP作为E3连接酶的结构与功能研究  21-24
      2.1 动物中同源基因CHIP的研究  22-23
      2.2 植物基因AtCHIP的研究现状  23-24
    3.叶绿体蛋白酶基因的研究现状  24-26
      3.1 主要蛋白酶基因  24-25
      3.2 叶绿体中蛋白酶的分布示意图  25-26
  第三章 泛素-蛋白酶体系及蛋白质调控  26-28
    1.泛素-蛋白酶体系  26-27
      1.1 泛素  26
      1.2 泛素-蛋白酶体系中的主要酶(体)  26-27
      1.3 蛋白酶体(proteasome)  27
    2.泛素-蛋白酶体系与蛋白质降解  27-28
  第四章 桑树遗传和生物工程的研究与应用进展  28-38
    1.桑树的遗传资源及其利用  28-32
      1.1 桑树种质资源及遗传育种  28-30
      1.2 细胞工程及在桑树育种中的应用  30-32
    2.桑树的基因工程  32-35
      2.1 供转化的基因  32
      2.2 转化途径  32-33
      2.3 桑树转基因研究现状与进展  33-34
      2.4 桑树转基因技术存在的问题  34-35
    3.桑树基因的分离和利用现状  35-38
      3.1 植物基因克隆技术  35-36
      3.2 桑树等木本植物分子标记和基因克隆  36-38
第二部分 材料与方法  38-50
  第五章 材料与方法  38-50
    1.材料  38-39
      1.1 植物材料及处理  38
      1.2 主要质粒与酵母菌菌种  38-39
      1.3 大肠杆菌质粒与菌株  39
    2.方法  39-48
      2.1 质粒的构建  39-40
      2.2 拟南芥cDNA文库的滴定  40
      2.3 酵母菌感受态细胞的制备，转化及质粒DNA的提取，纯化  40-41
      2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备，转化及质粒DNA的提取，纯化  41-42
      2.5 AtCHIP互作基因(猎物基因)的筛选  42
      2.6 酵母菌双杂技术中假阳性克隆的排除  42
      2.7 AtCHIP互作基因DNA序列结果分析  42-43
      2.8 PET系统及质粒的构建，蛋白质的表达和提取  43-44
      2.9 PET系统表达蛋白的纯化  44-45
      2.10 体外泛素—蛋白质结合试验和检测  45
      2.11 AtCHIP转基因植株逆境下若干互作蛋白和相关蛋白质的的消长  45
      2.12 用基因过量表达，反义技术研究AtCHIP互作基因ClpP4的功能  45-46
      2.13 用基因过量表达，反义技术研究AtCHIP互作基因的功能  46
      2.14 桑树基因AtNHX1的克隆及拟南芥的转化  46-48
    3.研究思路与技术路线  48-50
第三部分 结果与分析  50-81
  第六章 酵母双杂技术研究拟南芥基因AtCHIP的蛋白质互作基因  50-55
    1.拟南芥cDNA文库滴定  50-51
      1.1 滴定结果  50
      1.2 候选阳性克隆的初次筛选  50-51
    2.阳性“猎物”克隆的筛选  51-52
      2.1 酵母菌质粒DNA转化大肠杆菌KC8  51
      2.2 KC8质粒DNA的提取，转化  51-52
    3.假阳性克隆的排除  52-53
      3.1 回转试验结果  52
      3.2 β-半乳糖培养基筛选  52-53
    4.阳性克隆DNA测序及分析  53-55
      4.1 供测序的阳性克隆DNA  53
      4.2 测序结果与拟南芥Genebank分析  53-55
  第七章 AtCHIP若干互作基因的蛋白质表达及体外泛素—蛋白质结合试验  55-59
    1.蛋白质表达质粒构建，大肠杆菌BL21转化  55
    2.目标蛋白的诱导，提取，纯化  55-57
    3.AtCHIP作E3连接酶的泛素化作用及测验  57-58
    4.AtCHIP在逆境胁迫下蛋白互作中的位置分析  58-59
  第八章 AtCHIP转基因植株逆境下若干互作蛋白的消长  59-64
    1.AtCHIP过量表达植株正常条件下Clp的蛋白质  59
    2.AtCHIP过量表达植株低温处理下Clp的蛋白质  59-60
    3.AtCHIP过量表达植株高温处理下Clp的蛋白质  60
    4.AtCHIP若干互作基因在植物光合修复中的作用  60-64
      4.1 植物光损伤后的酶修复体系  60-61
      4.2 AtCHIP过量表达植株强光处理下的表型及Clp、Deg和FtsH的蛋白质  61-63
      4.3 AtCHIP过量表达植株强光处理下D1蛋白质与AtCHIP的调控  63-64
  第九章 AtCHIP互作基因ClpP4的功能研究  64-70
    1.ClpP4基因敲除植株的鉴定  64-66
    2.ClpP4基因敲除后植株的表型  66-67
    3.ClpP4基因过量表达及反义转基因植株的鉴定  67-69
      3.1 转基因植株的PCR鉴定  67-68
      3.2 转基因植株的Northern Blot鉴定  68-69
      3.3 转基因植株的Western Blot鉴定  69
    4.ClpP4基因过量表达及反义转基因植株的表型  69-70
  第十章 桑树(Morus alba Linne)基因mNHX1的克隆及其功能研究  70-75
    1.桑树基因NHX1的克隆  70-71
      1.1 RT-PCR法合成桑芽cDNA  70-71
      1.2 PCR扩增桑芽基因mNHX1 cDNA  71
      1.3 mNHX1的克隆、鉴定  71
    2.桑树基因mNHX1转拟南芥植株的鉴定  71-72
      2.1 转基因植株纯系  71
      2.2 转基因植株的PCR鉴定  71-72
    3.拟南芥转基因植株的表型  72-75
      3.1 盐浓度与转基因种子发芽率  72-74
      3.2 盐浓度与转基因植株的生长  74-75
  第十一章 讨论与结论  75-81
    1.讨论  75-79
      1.1 酵母菌双杂技术的实践与应用  75
      1.2 翻译后蛋白调控  75-76
      1.3 AtCHIP互作蛋白UBQ1、UBQ5—泛素因子  76
      1.4 AtCHIP互作蛋白UBC8、UBC9和UBC10—泛素缀合酶蛋白E2  76
      1.5 AtCHIP互作蛋白ATP依赖性Clp蛋白酶，FtSH蛋白酶  76-77
      1.6 AtCHIP是蛋白分解系统原核生物向真核生物发展的一个实例  77-79
    2.结论  79-81
参考文献  81-93
英文摘要  93-97
附录  97-105
  附录1.试剂、缓冲液和培养基的配制及主要仪器设备  97-102
  附录2.主要质粒构图  102-105
  附录3.博士期间形成的主要学术论文目录  105

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中图分类: > 生物科学 > 植物学 > 植物细胞遗传学 > 植物基因工程
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