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根特异表达TaEXPB23提高转基因烟草和拟南芥的渗透胁迫耐性

作　者: 李爱秀
导　师: 王玮
学　校: 山东农业大学
专　业: 植物学
关键词: 扩展蛋白根特异启动子PYK10 转基因植株抗旱性抗盐性抗氧化能力
分类号: Q945
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

干旱是农作物生长和产量形成的最主要限制因素。近年来，由于气候变化导致的干旱灾害呈逐年增加的趋势。小麦是世界性的粮食作物，干旱胁迫严重影响小麦的生长和产量。研究小麦的抗旱生理及分子机制对于提高干旱条件下小麦产量具有重要意义。本实验室前期从小麦胚芽鞘中克隆了扩展蛋白基因TaEXPB23（GenBank注册号：AY260547）。以前的研究表明，组成型过表达TaEXPB23能够提高植株的抗旱性，且转基因植株具有较野生型更强大的根系。但是组成型过表达TaEXPB23转基因烟草表现出前期生长加速、叶片较大；但生育周期变短，开花期提早，后期植株较野生型矮，总叶片数目减少、节间变长、叶片变小等形状。本研究我们拟采用根特异表达TaEXPB23的方法，在保持转基因植株抗旱性的基础上，试图减少这些负面影响。主要结果如下：（1）首先从拟南芥中获得了根特异表达的启动子PYK10，并将其与TaEXPB23基因连接，构建了表达载体P10::TaEXPB23，转化烟草和拟南芥，获得了根特异性表达TaEXPB23基因的转基因烟草和拟南芥。（2）表型观察与统计结果显示，根特异表达的转基因烟草#2、#10和#30相对于野生型烟草具有较庞大的根系统。与野生型相比，根重和侧根数增加了约50%，增加了根茎比。与增强的根系统相比，根特异表达TaEXPB23的转基因植株地上部的生长几乎没有受到影响。在正常生长条件下，茎节间长度、最终叶片数、开花时间等，与野生型相比都没有明显变化。（3）水分胁迫下P10::TaEXPB23转基因植株种子比野生型烟草种子萌发率高，转基因幼苗的生长状况比野生型烟草幼苗好。（4）水分胁迫下P10::TaEXPB23转基因植株的光合速率、实际光化学效率都比野生型植株稳定。（5）水分胁迫下，与野生型相比，P10::TaEXPB23转基因植株的水分维持状况得到改善。转基因植株的水分散失率比野生型慢，相对含水量比野生型高。（6）水分胁迫下P10::TaEXPB23转基因植株的抗氧化能力也得到了改善。转基因烟草比野生型烟草细胞内的H₂O₂积累量少，氧化胁迫较轻，同时过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性明显高于野生型。（7）水分胁迫下P10::TaEXPB23转基因植株羰基化蛋白的积累量比野生型的少，表明被氧化的蛋白质积累少。（8）盐胁迫下P10::TaEXPB23转基因植株（烟草和拟南芥）种子的萌发率和幼苗的生长都比野生型好。以上研究结果表明，根特异表达TaEXPB23通过增强的根系统和提高的抗氧化能力增强了转基因烟草和拟南芥的渗透胁迫耐性，但是对其正常生长条件下的表型没有明显影响。

全文目录

符号说明  4-9
中文摘要  9-11
Abstract  11-14
1 前言  14-26
  1.1 扩展蛋白的发现  14
  1.2 扩展蛋白的基因家族及蛋白结构  14-16
    1.2.1 扩展蛋白的蛋白结构  14-15
    1.2.2 扩展蛋白基因家族  15-16
  1.3 扩展蛋白的特性  16-17
    1.3.1 扩展蛋白的定位  16
    1.3.2 扩展蛋白的作用机理  16-17
  1.4 扩展蛋白在植物生长发育中的功能  17-19
    1.4.1 扩展蛋白与植株的生长发育  17-18
    1.4.2 扩展蛋白与根系生长和根毛发育  18-19
  1.5 扩展蛋白与植物的抗逆性  19-22
    1.5.1 扩展蛋白与植物抗旱性  19-20
    1.5.2 扩展蛋白与淹水条件下植物的生长  20
    1.5.3 扩展蛋白与植物的耐盐性  20-21
    1.5.4 扩展蛋白与生物胁迫耐性  21-22
  1.6 启动子在植物抗逆研究中的作用  22-24
    1.6.1 组成型启动子的应用  22-23
    1.6.2 诱导型启动子的应用  23
    1.6.3 组织特异启动子的应用  23-24
  1.7 本研究的目的及意义  24-26
2 材料与方法  26-45
  2.1 试验材料与处理  26-28
    2.1.1 植物材料  26
    2.1.2 材料培养与处理  26
    2.1.3 菌株与质粒  26-27
    2.1.4 酶及生化试剂  27
    2.1.5 PCR 引物  27
    2.1.6 培养基  27-28
  2.2 分子生物学实验方法  28-43
    2.2.1 CTAB 法微量法提取基因组 DNA  28-29
    2.2.2 目的基因 PYK10 的启动子片段的分离  29
    2.2.3 目的基因 TaEXPB23 的分离  29-30
    2.2.4 P10::TaEXPB23 表达载体的构建  30-31
    2.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化  31-32
    2.2.6 根癌农杆菌介导的转化  32-33
    2.2.7 利用 TRIZOL 试剂盒提取 RNA  33-34
    2.2.8 反转录第一条链 cDNA 的合成  34
    2.2.9 转基因植株的鉴定  34-36
    2.2.10 羰基化蛋白 Western Blot 检测  36-40
    2.2.11 转基因植株生理指标的测定  40-43
  2.3 根特异表达扩展蛋白基因转化拟南芥及其转基因拟南芥分子鉴定  43-44
    2.3.1 拟南芥转化  43-44
    2.3.2 转基因拟南芥的鉴定  44
  2.4 统计分析  44-45
3 结果与分析  45-65
  3.1 根特异启动子的获得和转化  45-50
    3.1.1 拟南芥 PYK10 基因启动子的获得  45-46
    3.1.2 P10::TaEXPB23 表达载体的构建和转化  46-48
    3.1.3 P10::TaEXPB23 转基因植株的鉴定  48-50
  3.2 P10::TaEXPB23 过表达植株表现出扩大的根系统而地上部生长正常  50-53
  3.3 根特异表达 TaEXPB23 基因对转基因植株抗旱性的影响  53-61
    3.3.1 根特异性过表达 TaEXPB23 提高了转基因烟草的抗水分胁迫能力  53-56
    3.3.2 根特异表达 TaEXPB23 提高了转基因拟南芥的抗水分胁迫能力  56-58
    3.3.3 水分胁迫对根特异性过表达 TaEXPB23 光合作用的影响  58
    3.3.4 水分胁迫对根特异性过表达 TaEXPB23 转基因植株相对电导和 MDA 的影响  58-59
    3.3.5 水分胁迫对根特异性过表达 TaEXPB23 转基因植株活性氧积累的影响  59-61
    3.3.6 水分胁迫对根特异性过表达 TaEXPB23 转基因植株抗氧化酶活性的影响  61
  3.4 根特异表达 TaEXPB23 基因增强了转基因植株对盐胁迫的耐性  61-65
    3.4.1 根特异表达 TaEXPB23 基因增强了转基因烟草对盐胁迫的抗性  61-63
    3.4.2 根特异表达 TaEXPB23 基因增强了转基因拟南芥对盐胁迫的抗性  63-65
4 讨论  65-69
5 结论  69-70
参考文献  70-78
致谢  78-79
攻读学位期间发表论文情况  79

根特异表达TaEXPB23提高转基因烟草和拟南芥的渗透胁迫耐性

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