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土曲霉发酵生产衣康酸过程中形态控制及低氧毒害原因初探

作　者: 高倩
导　师: 刘立明
学　校: 江南大学
专　业: 微生物学
关键词: 土曲霉衣康酸发酵优化形态控制低氧毒害
分类号: TQ920.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

丝状真菌广泛应用于发酵生产有机酸、酶制剂和抗生素。提高目标产物的生产效率、探究抑制产物合成效率的生理机制成为丝状真菌研究的热点和难点。本文以Aspergillusterreus FMME033发酵生产衣康酸为研究模型，借助发酵优化和丝状真菌形态控制两种策略提高衣康酸的生产效率，同时对低氧胁迫抑制衣康酸积累的原因进行初探，主要研究结果如下：1.影响A. terreus发酵生产衣康酸的关键因素之一是营养与环境条件。在摇瓶上得出最适合的初始pH为3.0，最佳培养基组成为：葡萄糖80g/L，（NH₄）₂SO₄4g/L，玉米浆3g/L，MgSO₄·7H₂O0.11g/L，FeSO₄·7H₂O0.04g/L，ZnSO₄·7H₂O0.05g/L，此时衣康酸产量达到28.2g/L，是优化前衣康酸产量（14.2g/L）的2倍；2.影响衣康酸发酵的另一个关键因素是A. terreus的菌体形态。（1）在摇瓶水平上获得发酵液中A. terreus的菌体形态分别以菌丝为主、菌团为主和菌球为主，且以菌团为主时利于衣康酸积累；（2）单位细胞合成衣康酸的能力（R²=0.9809）和单位细胞消耗葡萄糖的能力（R²=0.9421）与菌团直径密切相关，最佳菌团直径范围为0.40-0.50mm，此时单位细胞合成衣康酸的能力和消耗葡萄糖的能力分别比对照提高35.4%和27.5%；（3）在7-L发酵罐上将A. terreus菌团直径控制在0.45mm，单位细胞合成衣康酸的能力和消耗葡萄糖的能力比调控前分别提高25.1%和16.3%。说明A. terreus的菌体形态与衣康酸生产效率关系密切；3.衣康酸发酵过程一个典型特征是对短暂低氧环境具有高度敏感性，产生低氧胁迫抑制衣康酸积累。对这一现象进行初探，发现：静置培养5min引起胞内活性氧（Reactive oxygen species，ROS）含量激增，导致羰基化蛋白质含量大幅上升，最大值为持续振荡培养的2.7倍；且菌体上形成体积更大、数量更多的孢子囊，线粒体中乌头酸酶活性显著降低，40h时比活性最低，仅为持续振荡培养的6.9%。发酵结束时，静置培养5min的衣康酸产量、葡萄糖消耗量和菌体干重分别为持续振荡培养的54.9%、56.9%和76.6%。说明低氧胁迫引起细胞内蛋白损伤，抑制衣康酸积累。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-6
目录  6-8
第一章绪论  8-18
  1.1 丝状真菌的应用领域  8
  1.2 A.terreus 发酵生产衣康酸的研究进展  8-11
    1.2.1 A. terreus 生产衣康酸的发展及其代谢途径解析  8-9
    1.2.2 衣康酸发酵条件的研究  9-10
    1.2.3 衣康酸生产菌株的传统选育及代谢工程改造  10-11
  1.3 丝状真菌形态工程研究进展  11-14
    1.3.1 形态工程  11-12
    1.3.2 菌体形态对发酵液流变性能、营养物质转运和代谢产物的影响  12
    1.3.3 影响丝状真菌形态的因素  12-14
    1.3.4 控制丝状真菌形态的策略  14
  1.4 低氧胁迫及其毒害机制  14-16
    1.4.1 低氧胁迫产生机制  14
    1.4.2 低氧胁迫对细胞的毒害机制  14-15
    1.4.3 低氧胁迫对 A. terreus 毒害的研究进展  15-16
  1.5 本论文研究目的与意义  16
  1.6 本论文主要研究内容  16-18
第二章材料与方法  18-22
  2.1 材料  18-19
    2.1.1 菌种  18
    2.1.2 培养基  18
    2.1.3 仪器  18-19
    2.1.4 试剂  19
  2.2 实验方法  19-22
    2.2.1 培养方法  19
    2.2.2 分析方法  19-22
第三章结果与讨论  22-39
  3.1 基于营养与环境条件优化提高衣康酸产量  22-26
    3.1.1 初始 pH 对衣康酸发酵的影响  22-23
    3.1.2 葡萄糖、(NH_4)_2SO_4和玉米浆单因素实验对衣康酸发酵的影响  23-24
    3.1.3 葡萄糖、(NH_4)_2SO_4和玉米浆正交实验对衣康酸发酵的影响  24
    3.1.4 金属离子单因素实验对衣康酸发酵的影响  24-25
    3.1.5 金属离子正交实验对衣康酸发酵的影响  25-26
  3.2 基于形态控制策略提高衣康酸产量  26-34
    3.2.1 环境条件对 A. terreus 形态的影响  26-27
    3.2.2 A. terreus 菌体形态与发酵液流变性能的关系  27-29
    3.2.3 A. terreus 菌体形态对衣康酸发酵的影响  29
    3.2.4 KH2PO4浓度和培养温度对菌团大小和衣康酸发酵的影响  29-33
    3.2.5 发酵罐中控制 A. terreus 菌团直径提高衣康酸生产效率  33-34
  3.3 低氧胁迫损伤蛋白质抑制衣康酸积累  34-39
    3.3.1 持续振荡培养和短暂静置培养对衣康酸发酵的影响  34-35
    3.3.2 持续振荡培养和短暂静置培养对 A. terreus 形态的影响  35-36
    3.3.3 持续振荡培养和短暂静置培养对 A. terreus 胞内 ROS 含量的影响  36-37
    3.3.4 持续振荡培养和短暂静置培养对 A. terreus 胞内氧化损伤蛋白质含量的影响  37
    3.3.5 持续振荡培养和短暂静置培养对 A. terreus 线粒体乌头酸酶活性的影响  37-39
主要结论与展望  39-41
  主要结论  39-40
  展望  40-41
致谢  41-42
参考文献  42-47
附录  47

土曲霉发酵生产衣康酸过程中形态控制及低氧毒害原因初探

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