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枯草芽孢杆菌中Sec分泌途径底物特性及非经典分泌途径的研究

作　者: 王光强
导　师: 陈卫
学　校: 江南大学
专　业: 食品科学
关键词: 枯草芽孢杆菌蛋白质分泌不折叠蛋白质信号肽耐热乳糖酶BgaB 稀有密码子非经典分泌蛋白质
分类号: TS201.3
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

蛋白质分泌(protein secretion)是指蛋白质由合成部位细胞质到细胞外的过程。由于分泌的蛋白质易于纯化，简化了下游操作步骤，便于蛋白质折叠和利于以较低的成本获得可溶的和有活性的目标蛋白质，所以分泌表达是一种较为理想的外源蛋白质表达方式。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一般认为安全(Generally RecognizedAs Safe, GRAS)的食品级微生物，具有较好的分泌能力，易于培养，基因操作相对简单和发酵工艺也较为成熟等优点，因此它被认为是理想的外源蛋白质的表达宿主菌，大量来源于不同生物的外源基因已经在枯草芽孢杆菌中实现了分泌表达，但分泌量低这一瓶颈仍未得到解决，这也是限制其作为“细胞工厂”来生产目标蛋白质的重要原因。为了探究部分蛋白质在枯草芽孢杆菌中分泌效率低下的原因，我们首先利用生物信息学的方法比较了该菌种细胞质蛋白质(cytoplasmic protein)与分泌蛋白质成熟部分(mature protein)中氨基酸分布的规律，在此基础上进一步研究了在枯草芽孢杆菌中不折叠蛋白质(intrinsically disordered proteins)在不同分泌信号引导下的分泌特点，并尝试通过改变目的蛋白质的性质而实现其分泌表达，最后探讨了枯草芽孢杆菌中一种新的途径—非经典蛋白质分泌途径(non-classical protein secretion pathway)，试图利用这一途径分泌表达外源蛋白质。论文的主要研究结果如下：(1)本实验室的前期工作中一直尝试利用不同的Sec信号肽分泌表达耐热乳糖酶BgaB，但均没有成功。目前并不知道像BgaB一样的细胞质蛋白质为什么加上不同的信号肽也不会被分泌到细胞外，它们的哪些性质阻碍其分泌。为了回答以上问题，在第二章中，我们利用python语言编写的程序分析了枯草芽孢杆菌中241种Sec型分泌蛋白质的成熟部分与457种细胞质蛋白质中氨基酸组成差异，结果发现成熟蛋白质的前14位氨基酸主要由不折叠氨基酸(disorder-promoting amino acids)组成，而细胞质蛋白质的主要由促折叠氨基酸(order-promoting amino acids)组成。这表明成熟蛋白质的N端主要为不折叠结构，而这一结构可为成熟蛋白质与多个不同的蛋白质的结合提供结合位点；而细胞质蛋白质的此部分区域可能较容易的折叠成高级结构，从而导致其无法进入分泌途径，而使分泌失败。(2)由于同一种蛋白质在不同信号肽引导下分泌效率相差会很大，目前的研究主要通过高通量信号肽筛选的方法获得对应蛋白的最佳分泌信号。但是目前对于一个给定的蛋白质，还无法预测哪个信号肽能有效的引导其分泌，也不清楚在不同信号肽引导下其分泌效率不同的原因。论文的第三章研究内容是尝试利用不同的信号肽分泌表达酿酒酵母来源的核孔蛋白质的不折叠部分(intrinsically disordered domain of nucleoskeletal-likeprotein, Nsp)，研究结果发现在所有Sec信号肽引导下，Nsp均能被分泌到细胞外(胞内无Nsp存在)，而且分泌量很大。这说明分泌时的蛋白质的结构对蛋白质分泌效率(量)起着非常重要的作用。当蛋白质的结构适合分泌时，所有的信号肽都能有效的分泌此蛋白质。因此我们认为信号肽在抑制蛋白质折叠中起着重要的作用；对于某种蛋白质，一个“好”的信号肽就是抑制这种蛋白质折叠能力强的信号肽，也就是说信号肽的抑制折叠的能力决定了其引导的蛋白质的分泌效率。当利用Tat信号肽和非经典分泌蛋白质分泌Nsp时，Nsp分泌效率降低而且在胞内亦能检测到Nsp蛋白质。(3)耐热β-半乳糖苷酶BgaB具有热稳定性好，作用温度适宜及最适作用pH为中性等优点，具有较强的工业应用潜力。本实验室的前期研究中发现，大量的Sec信号肽并不能引导BgaB分泌至细胞外。本论文第四章尝试通过去掉BgaB的N端促折叠氨基酸，把BgaB的3至11位氨基酸和35至44位氨基酸的编码序列变成稀有密码子簇的方式分泌表达BgaB，但在所有的组合中均没有成功实现BgaB的分泌表达。进一步，我们以来源于大肠杆菌的碱性磷酸化酶PhoA为报告蛋白质进一步研究BgaB不能分泌的原因，发现BgaB的多个片段和插入的片段长度均阻碍其分泌表达。(4)非经典分泌蛋白质一般在稳定期被大量释放到细胞外，但此类蛋白质不存在经典的可切除的信号肽。本文第五章研究发现非经典分泌蛋白质不是特定时期的产物，当过表达这些蛋白质时，它们在对数期也能被大量的分泌到细胞外。当把非经典分泌蛋白质当作分泌信号时，成功分泌表达了不折叠蛋白质Nsp，碱性磷酸化酶PhoA和耐热乳糖酶BgaB。进一步，我们以Nsp作为报告蛋白质探索了非经典分泌蛋白质的分泌信号，发现15种非经典分泌蛋白质的前50个氨基酸和PdhB的前48个氨基酸能把报告蛋白质Nsp引导到细胞外。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-8
主要缩略词注释表  8-11
第一章绪论  11-24
  1.1 枯草芽孢杆菌  11-13
    1.1.1 枯草芽孢杆菌简介  11
    1.1.2 枯草芽孢杆菌作为基因工程平台的优势  11-12
    1.1.3 枯草芽孢杆菌的分泌蛋白质  12-13
  1.2 信号肽依赖的分泌途径  13-14
  1.3 外源蛋白质在枯草芽孢杆菌中的分泌表达  14-16
  1.4 非经典分泌途径 (non-classical protein secretion pathway)  16-22
  1.5 研究目的与意义  22-23
  1.6 研究内容  23-24
第二章成熟蛋白质与细胞质蛋白质中氨基酸组成上的差异  24-33
  2.1 引言  24-26
  2.2 数据收集与分析  26-28
    2.2.1 数据分类  26
    2.2.2 数据分析  26-28
  2.3 结果与讨论  28-32
    2.3.1 不折叠氨基酸在成熟蛋白质与细胞质蛋白质中的比例分析  28-30
    2.3.2 带电荷氨基酸在信号肽两侧的分布  30-32
  2.4 本章小结  32-33
第三章不折叠蛋白质在不同信号肽引导下的分泌表达研究  33-48
  3.1 引言  33-34
  3.2 材料与方法  34-42
    3.2.1 菌株、质粒和培养基  34-35
    3.2.2 主要试剂  35
    3.2.3 主要仪器  35-36
    3.2.4 PCR 引物  36-37
    3.2.5 主要溶液的配置  37-38
    3.2.6 主要的实验方法  38-42
  3.3 结果与讨论  42-47
    3.3.1 重组枯草芽孢杆菌 WB800 菌株的构建  42-43
    3.3.2 在不同 Sec 信号肽引导下，不折叠蛋白质 Nsp 的分泌研究  43-46
    3.3.3 Tat 信号肽引导下，Nsp 的分泌情况  46-47
    3.3.4 利用非经典分泌蛋白质分泌 Nsp 蛋白质  47
  3.4 本章小结  47-48
第四章耐热乳糖酶在 Sec 信号肽引导下的分泌表达研究  48-59
  4.1 引言  48
  4.2 材料与方法  48-54
    4.2.1 菌株、质粒和培养基  48-50
    4.2.2 主要试剂  50
    4.2.3 主要仪器  50
    4.2.4 PCR 引物  50-51
    4.2.5 主要溶液的配置  51
    4.2.6 主要的实验方法  51-54
  4.3 结果与讨论  54-57
    4.3.1 质粒的构建  54-55
    4.3.2 去除 2 位折叠氨基酸或含有稀有密码子的 BgaB 的分泌表达研究  55-56
    4.3.3 探究 BgaB 不能分泌的原因  56-57
  4.4 本章小结  57-59
第五章利用非经典分泌蛋白质分泌外源蛋白质  59-77
  5.1 引言  59-61
  5.2 材料与方法  61-65
    5.2.1 菌株、质粒和培养基  61-63
    5.2.2 主要试剂  63
    5.2.3 主要仪器  63
    5.2.4 PCR 引物  63-65
    5.2.5 主要溶液的配置  65
    5.2.6 实验方法  65
  5.3 结果与讨论  65-76
    5.3.1 非经典分泌蛋白质的分泌不是特定时期的产物  65-70
    5.3.2 利用非经典分泌途径分泌外源蛋白质  70-73
    5.3.3 利用 Nsp 作为报告蛋白质研究非经典分泌蛋白质的分泌信号  73-75
    5.3.4 非经典分泌蛋白质分泌信号肽的共性的探索  75-76
  5.4 本章小结  76-77
论文主要结论  77-78
论文创新点  78-79
致谢  79-80
参考文献  80-90
附录: 作者在攻读博士学位期间发表的论文  90

枯草芽孢杆菌中Sec分泌途径底物特性及非经典分泌途径的研究

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