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检测动物皮毛中6种致病菌的基因芯片技术研究

作　者: 冯松凯
导　师: 李苗云
学　校: 河南农业大学
专　业: 食品科学
关键词: 动物皮毛 6种致病菌基因芯片检测
分类号: S852.61
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

本研究根据WHO、OIE等权威机构公布的各国疾病流行情况和相关的文献资料，结合实验室病原分离、鉴定结果，以动物皮毛中常见的6种致病菌布氏杆菌、大肠杆菌O157、金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌、丹毒杆菌、铜绿假单胞杆菌等为研究对象，选择16srDNA基因和gyrB基因进行序列分析，设计两对通用引物和相应的多条细菌鉴别探针，研究同时检测6种致病菌的基因芯片检测方法，并进行实际应用效果评价。主要研究内容和结果如下：1.在对动物皮毛携带布氏杆菌、大肠杆菌O157、金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌、丹毒杆菌、铜绿假单胞杆菌等鉴定的基础上，采用CTAB法，酚氯仿法、NaI法和NaOH-SDS法分别提取6种致病菌的核酸，比较提取核酸含量、纯度和完整性，发现：酚氯仿法可作为基因芯片检测的通用核酸提取方法。2.选择在细菌生物学上具有重要意义的16s rDNA基因和gyrB基因，对6种致病菌的序列分析后分别设计2对通用引物和对应的1～5条特异性寡核苷酸探针，每条上游引物标记TAMARA荧光基团。使用芯片点样液将各个探针稀释为30μmol/L，点样制备检测基因芯片，每个矩阵为18×10阵列（行×列），每条探针5个重复点。建立每种细菌基于16s rDNA基因和gyrB基因的通用不对称的PCR方法，其产物与制备基因芯片杂交，优化并建立同时检测6种致病菌的基因芯片方法。结果表明：基因芯片最佳反应条件为使用47%甲酰胺杂交液，42℃杂交4h。该芯片的检测方法特异性好，仅与布氏杆菌、大肠杆菌O157、金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌、丹毒杆菌、铜绿假单胞杆菌等菌发生特异性反应，与蜡样芽孢杆菌、苏云金杆菌、大肠杆菌O152、李斯特杆菌、沙门氏菌和阪崎肠杆菌不产生假阳性反应。方法的灵敏度最低可达10拷贝数核酸。3.随机选取163份动物皮毛样品进行基因芯片检测，对杂交阳性样品进行细菌分离鉴定或相应的特异性PCR方法检测，检测符合率为100％，表明建立的动物皮毛中携带致病菌的基因芯片检测方法适合临床样品的批量检测。

全文目录

致谢  4-8
摘要  8-9
1 文献综述  9-21
  1.1 基因芯片技术在致病菌检测中的应用  9-16
    1.1.1 基因芯片技术简介  9-12
      1.1.1.1 基因芯片的类型  9-11
      1.1.1.2 基因芯片的技术流程  11-12
      1.1.1.3 基因芯片的用途  12
    1.1.2 常规方法检测致病菌的不足  12
    1.1.3 基因芯片检测致病菌的实用性与优越性  12-13
    1.1.4 基因芯片技术在致病菌检测上的应用  13-16
      1.1.4.1 基于细菌核糖体基因的芯片技术  13-14
      1.1.4.2 基于细菌“特异基因”的芯片技术  14-16
  1.2 动物皮毛中主要致病菌及其危害  16-21
    1.2.1 布氏杆菌  17
    1.2.2 大肠杆菌 O157  17-18
    1.2.3 金黄色葡萄球菌  18
    1.2.4 链球菌  18-19
    1.2.5 丹毒杆菌  19-20
    1.2.6 铜绿假单胞杆菌  20-21
2 引言  21
3 材料与方法  21-31
  3.1 试验菌株、试剂及仪器  21-22
    3.1.1 试验菌株  21-22
    3.1.2 主要试剂  22
    3.1.3 主要仪器  22
  3.2 试验内容和方法  22-31
    3.2.1 动物皮毛中携带致病菌的分离鉴定  22-24
      3.2.1.1 金黄色葡萄球菌的分离、鉴定  22-23
      3.2.1.2 乙型溶血性链球菌的分离、鉴定  23
      3.2.1.3 大肠杆菌 0157 的分离、鉴定  23
      3.2.1.4 铜绿假单胞杆菌的分离、鉴定  23
      3.2.1.5 丹毒杆菌的分离、鉴定  23
      3.2.1.6 布氏杆菌的鉴定  23-24
    3.2.2 动物皮毛中携带致病细菌核酸提取方法的研究  24-25
      3.2.2.1 细菌核酸 DNA 的提取  24-25
      3.2.2.2 PCR 鉴定  25
    3.2.3 动物皮毛中携带致病菌基因芯片检测方法的建立和应用  25-28
      3.2.3.1 引物和探针的设计  25-27
      3.2.3.2 不对称 PCR 方法的建立  27
      3.2.3.3 不对称 PCR 退火温度的优化  27-28
      3.2.3.4 不对称 PCR 敏感性试验  28
    3.2.4 动物皮毛中携带致病菌基因芯片检测方法的建立  28-31
      3.2.4.1 检测动物皮毛中携带致病菌基因芯片的制备  28-30
      3.2.4.2 动物皮毛中携带致病菌基因芯片杂交程序  30
      3.2.4.3 动物皮毛中携带致病菌芯片的洗涤  30
      3.2.4.4 动物皮毛中携带致病菌杂交芯片的扫描  30
      3.2.4.5 杂交条件优化  30-31
    3.2.5 动物皮毛中携致病菌检测基因芯片的特异性试验  31
    3.2.6 动物皮毛中携带致病菌检测基因芯片的敏感性试验  31
    3.2.7 实际应用  31
4 结果与分析  31-61
  4.1 动物皮毛中携带病原微生物的分离鉴定  31-33
    4.1.1 金黄色葡萄球菌分离鉴定结果  32
    4.1.2 乙型溶血性链球菌分离鉴定结果  32
    4.1.3 大肠杆菌 0157 分离鉴定结果  32
    4.1.4 铜绿假单胞杆菌分离鉴定结果  32
    4.1.5 丹毒杆菌分离鉴定结果  32
    4.1.6 布氏杆菌和检测抗原鉴定结果  32-33
  4.2 动物皮毛中携带致病菌核酸提取方法的研究结果  33-38
    4.2.1 提取细菌核酸电泳的结果  33-37
    4.2.2 不同提取方法步骤和时间的比较  37-38
  4.3 动物皮毛中携带致病菌基因芯片检测结果  38-61
    4.3.1 基于 16S rDNA 基因设计通用引物 PCR 扩增结果  38
    4.3.2 基于 gyrB 基因设计通用引物 PCR 扩增结果  38-39
    4.3.3 不对称 PCR 退火温度优化结果  39
    4.3.4 不对称 PCR 敏感性实验结果  39-42
      4.3.4.1 基于 16S rDNA 基因的不对称 PCR 的敏感性试验  39-41
      4.3.4.2 基于 gyrB 基因的不对称 PCR 的敏感性试验  41-42
    4.3.5 动物皮毛中携带致病菌基因芯片杂交实验结果  42-47
      4.3.5.1 杂交液筛选结果  42
      4.3.5.2 杂交时间优化结果  42-47
    4.3.6 动物皮毛中携带致病菌检测基因芯片特异性实验结果  47-52
    4.3.7 动物皮毛中携带致病菌检测基因芯片敏感性实验结果  52-59
    4.3.8 实际应用结果  59-61
5 结论与讨论  61-63
  5.1 讨论  61-63
    5.1.1 动物皮毛携带致病菌核酸提取方法结果讨论  61-62
    5.1.2 动物皮毛中携带致病菌基因芯片检测方法的建立结果讨论  62-63
  5.2 结论  63
6 创新点  63-64
7 研究生期间发表论文  64-65
参考文献  65-72
ABSTRACT  72-73

检测动物皮毛中6种致病菌的基因芯片技术研究

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