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羊口疮病毒甘肃流行株的分离鉴定及其重要功能基因的克隆与表达分析

作　者: 白刚
导　师: 吴润
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 羊口疮病毒 分离鉴定 重要功能基因 克隆与序列分析 酵母表达 BHK-21细胞表达 G4L蛋白结构预测
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


【目的】从中国甘肃省榆中县北山地区疑似羊口疮病毒（Orf virus，ORFV）感染患病绵羊的脓疱和痂皮中分离1株ORFV流行株，克隆其5种锚定蛋白基因，利用真核表达载体pEGFP-N1和BHK-21细胞表达锚定蛋白基因ORF129，为ORFV感染调控宿主免疫应答机制研究提供细胞模型；利用真核表达载体GS115-pPIC9K和酵母表达ORFV ORF040基因，为ORFV G4L蛋白生物学功能研究和分子疫苗制备提供实验材料。【方法】（1）采用羊睾丸原代细胞（Lamb testis cells，LT）分离中国甘肃榆中地区绵羊ORFV毒株，设计特异性引物，扩增该毒株B2L、F1L全长基因，对比国内外其他毒株的相关序列构建系统进化树，确定相互间的遗传进化关系。（2）根据GenBank中登录的ORFV-OV00株基因组序列（登录号: DQ184476）设计5对特异性引物，扩增、克隆ORFV流行毒株的5种锚定蛋白基因并作序列和结构预测分析；构建ORF129基因真核表达载体pEGFP-ORFV-ORF129，转染BHK-21细胞，经鉴定获得ORF129基因的BHK-21细胞表达系统。（3）设计1对ORFV ORF040基因特异性引物，进行该基因的扩增、测序和序列与结构的预测分析，构建其真核表达载体GS115-pPIC9K-ORF040，转化酵母菌并筛选高拷贝重组酵母表达菌株，经甲醇诱导表达后进行重组蛋白的SDS-PAGE鉴定和纯化。【结果】（1）从中国甘肃省榆中县北山地区疑似羊口疮患病绵羊的脓疱和痂皮中分离到1株ORFV毒株，命名为ORFV/GSYZ/China（简称GSYZ毒株）；以特异性引物扩增出该毒株的B2L与F1L全长基因，B2L基因的系统发生关系分析表明，该毒株与新疆、GanSu2009（HQ694772）毒株的亲缘关系最近，与新西兰NZ2株、印度分离株（DQ263305）亲缘关系较近，与湖北、辽宁、山西、台湾等地的分离株亲缘关系较疏远，表明GSYZ毒株与流行于新疆地区的毒株同源。(2)获得GSYZ毒株的5种锚定蛋白基因克隆，其中ORF008大小为1548bp、编码515个氨基酸，ORF123为1578bp、编码525个氨基酸，ORF126为1494bp、编码497个氨基酸，ORF128为1506bp、编码501个氨基酸，ORF129为1551bp、编码516个氨基酸，与国外羊口疮病毒分离株的锚定蛋白基因核苷酸同源性为96.7%～98.4%。其推导氨基酸序列显示，这5种锚定蛋白在结构上是相似的，具有锚定蛋白家族的典型结构特征，氨基端具有6～9种锚定蛋白重复序列（Ankyrin repeats，ANK）的基序；二级结构分析显示，5种锚定蛋白α螺旋和β折叠的含量高，分别达69%～86.9%与41.4%～58.1%，而无规卷曲的含量仅占7.1%～9.1%；同源建模比对，未发现与之匹配的三级结构。构建了该毒株ORF129基因真核表达质粒pEGFP-ORFV-ORF129及其BHK-21细胞表达系统，经荧光显微镜、基因组DNA和RNA水平及Western-blot鉴定，ORF129在BHK-21细胞中得到稳定表达。（3）扩增并克隆了GSYZ毒株的ORF040基因，其大小为414bp、可编码137个氨基酸；构建了ORF040基因真核表达质粒GS115-pPIC9K-ORF040及其酵母表达系统，经甲醇诱导重组酵母可成功表达分子量约为16ku的目的蛋白，其大小与理论推测分子质量相一致；G4L蛋白结构与亚细胞定位预测表明，其可能有8个磷酸化修饰位点，其中丝氨酸5个（第6、121、124、133、135位）、苏氨酸2个（第28、68位）、酪氨酸1个（第78位），该蛋白出现在细胞质的概率最大（65.2%）、其次为细胞核和线粒体中（均为8.7%）。【结论】（1）从甘肃省榆中县北山地区绵羊中分离到一株ORFV毒株——ORFV/GSYZ/Chin（a简称GSYZ毒株）；（2）获得GSYZ毒株的5种锚定蛋白基因克隆，并以其中的ORF129基因作为研究对象，实现了其在真核细胞中的表达；（3）成功克隆并在酵母中表达了GSYZ毒株的ORF040基因，对其表达产物进行了纯化和结构预测分析。本文旨在为进一步研究ORFV感染宿主的机制及分子疫苗的开发奠定坚实的物质基础。

全文目录


摘要  3-5
Summary  5-10
缩略词中英文对照表  10-11
第一章 绪论  11-20
  1 羊口疮病毒的研究进展  11-15
    1.1 羊口疮概述  11
    1.2 病原分类学特征  11
    1.3 病原形态特征  11-12
    1.4 病原基因组学  12
    1.5 病理变化与临床症状  12-13
    1.6 流行病学  13
    1.7 羊口疮的防控技术  13-15
  2 锚定蛋白重复序列研究进展  15-17
    2.1 锚定蛋白家族概述  15
    2.2 痘病毒编码锚定蛋白的结构与数量  15-16
    2.3 痘病毒编码锚定蛋白的作用机制  16-17
  3 G4L 蛋白的研究进展  17-18
    3.1 谷氧还蛋白研究进展  17
    3.2 痘病毒编码的 G4L 蛋白作用机制  17-18
  4 研究目的及意义  18
  5 研究内容和方法  18-20
第二章 羊口疮甘肃流行毒株的分离与鉴定  20-29
  1 材料与方法  20-22
    1.1 材料  20-21
      1.1.1 病料  20
      1.1.2 细胞系与菌株  20
      1.1.3 主要试剂与耗材  20-21
      1.1.4 实验仪器设备  21
    1.2 方法  21-22
      1.2.1 病料处理  21
      1.2.2 病料检测  21
      1.2.3 羊口疮病毒 B2L 与 F1L 基因的扩增、克隆及系统发育分析  21-22
      1.2.4 病毒的分离及传代培养  22
  2 结果与分析  22-27
    2.1 发病绵羊的临床症状  22-23
    2.2 临床样品的 PCR 检测  23
    2.3 病毒的体外分离培养  23-24
    2.4 羊口疮病毒 B2L 基因与 F1L 基因的扩增、克隆及系统发育分析  24-27
  3 讨论  27-29
第三章 羊口疮病毒锚定蛋白基因的克隆、鉴定及在 BHK-21 中的表达  29-39
  1 材料与方法  29-32
    1.1 材料  29-30
      1.1.1 菌种、质粒及细胞  29
      1.1.2 主要试剂和耗材  29-30
      1.1.3 实验仪器和设备  30
    1.2 方法  30-32
      1.2.1 引物的设计  30
      1.2.2 目的基因的 PCR 扩增及克隆  30-31
      1.2.3 生物信息学分析  31
      1.2.4 pEGFP-ORFV-ORF129 真核表达质粒的构建及提取  31
      1.2.5 BHK-21 细胞培养及重组质粒的转染  31
      1.2.6 pEGFP-ORFV-ORF129 真核表达质粒转染后鉴定  31-32
  2 结果与分析  32-37
    2.1 目的基因的扩增、克隆及鉴定  32-37
      2.1.1 5种锚定蛋白分子的扩增、克隆及鉴定  32
      2.1.2 ORFV ORF129 基因的扩增、克隆及鉴定  32
      2.1.3 5种锚定蛋白基因的生物信息学分析  32-35
      2.1.4 重组表达质粒 pEGFP-ORFV-ORF129 的构建及鉴定  35-36
      2.1.5 重组表达质粒 pEGFP-ORFV-ORF129 在 BHK-21 细胞中的表达及鉴定  36-37
  3 讨论  37-39
第四章 羊口疮病毒 ORF040 基因的克隆及在毕赤酵母中的表达与结构预测分析  39-49
  1 材料与方法  39-43
    1.1 材料  39-40
      1.1.1 菌株与载体  39-40
      1.1.2 主要试剂和耗材  40
      1.1.3 主要培养试剂  40
      1.1.4 主要仪器设备  40
    1.2 方法  40-43
      1.2.1 表达引物的设计  40-41
      1.2.2 目的基因的扩增  41
      1.2.3 重组表达载体 pPIC9K-ORF040 的构建  41
      1.2.4 重组表达载体 pPIC9K-ORF040 电转化毕赤酵母 GS115  41-42
      1.2.5 高拷贝重组酵母菌株的筛选与鉴定  42
      1.2.6 重组酵母菌株 GS115-pPIC9K-ORF040 的诱导表达  42
      1.2.7 表达产物的 SDS-PAGE 分析  42-43
      1.2.8 表达产物的切胶纯化  43
      1.2.9 ORF040 基因的序列分析及蛋白质的结构预测  43
  2 结果与分析  43-47
    2.1 目的基因的 PCR 扩增  43
    2.2 重组表达质粒 pPIC9K-ORF040 菌液 PCR 与双酶切鉴定  43
    2.3 重组酵母菌株 GS115-pPIC9K-ORF040 的鉴定  43-44
    2.4 目的蛋白的 SDS-PAGE 分析  44
    2.5 目的蛋白的纯化结果  44-45
    2.6 ORF040 基因的序列特性及二级结构的预测  45-46
    2.7 G4L 蛋白的信号肽及修饰位点预测  46-47
  3 讨论  47-49
结论  49-50
致谢  50-51
参考文献  51-56
作者简介  56-57
导师简介  57-59

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学
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