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Quorum sensing、GacS/GacA和RpoS对荧光假单胞菌2P24胞内合成聚羟基脂肪酸酯的调控

作　者: 李浩
导　师: 宋水山
学　校: 河北工业大学
专　业: 生物化工
关键词: 聚羟基脂肪酸酯双因子调控系统转录调节因子荧光假单胞菌
分类号: Q93
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates, PHA)是许多细菌在非平衡生长条件下在胞内积累的以颗粒状态存在的碳源和能源储藏物质[1]。PHA因其具有生物可降解性、生物相容性等许多良好的材料性质、可以作为化学合成塑料未来的替代品而引起广泛关注。近年来对PHA的研究和开发工作主要集中于筛选和构建PHA高产菌株以及生物合成PHA的低廉底物，但对PHA生物合成的调控机制研究的相对较少。细菌群体感应系统(Quorum-sensing, QS)、双因子调控系统(two-component regulatorysystem)GacS/GacA、转录调节因子RpoS在细菌感受环境信号过程中发挥重要的调控作用。然而三者在细菌胞内合成PHA过程中的调控功能还知之甚少。本研究以荧光假单胞菌2P24为材料，采用分子遗传学、生物化学和细胞生物学方法探索QS、GacS/GacA和RpoS对菌体合成PHA的调控以及相互关系。研究首次发现荧光假单胞菌2P24可以利用葡萄糖酸钠或辛酸钠为唯一碳源在胞内合成PHA。当以葡萄糖酸钠为唯一碳源时，菌体合成以3-羟基癸酸为主要单体组分的PHA；而以辛酸钠为唯一碳源时，菌体合成以3-羟基辛酸为主要单体组分的PHA。本实验构建了各个调控基因的突变恢复菌株、过表达菌株。同时也构建了gacA/rpoS和gacS/rpoS的双突变菌株。检测野生型菌株及相关菌株胞内积累PHA的能力。结果表明，当以辛酸钠为唯一碳源培养时，PM201(△GacA)、PM202(△GacS)和PM303(△RpoS)的PHA积累量与2P24相比显著下降，而QS信号分子合成酶基因pcoI的突变株PM100(△PcoI)的PHA积累量与野生型相比没有明显差异。恢复gacA或gacS基因可以显著提高PHA的积累量，说明gacA/gacS基因和rpoS基因参与PHA的生物合成，并且发挥正调控作用。而pcoI基因不参与2P24利用辛酸钠为碳源合成PHA的过程。进一步分析发现gacA/rpoS和gacS/rpoS双突变株的PHA合成能力与rpoS突变体的相似，表明rpoS位于gacA/gacS的下游，对PHA的生物合成起关键作用。综上所述，在荧光假单胞菌2P24中rpoS和gacA/gacS参与菌体内PHA生物合成的调控。在以辛酸钠为碳源时，GacS/GacA系统可能通过调控rpoS进而调控PHA的生物合成。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-10
第一章绪论  10-19
  1.1 聚羟基脂肪酸酯简介  10-15
    1.1.2 PHA 的生物合成途径  11-12
    1.1.3 PHA 合成酶的分类  12-13
    1.1.4 PHA 的检测方法  13-14
    1.1.5 PHA 的应用  14-15
  1.2 2P24 的简介及其调控因子的介绍  15-18
    1.2.1 2P24 的简介  15
    1.2.2 群体感应调控系统  15-17
    1.2.3 GacA/GacS 双因子调控系统  17
    1.2.4 RpoS 转录调节因子  17-18
  1.3 课题的研究意义  18-19
第二章利用荧光假单胞菌 2P24 合成 PHA 及种类的鉴定  19-27
  2.1 材料  19-21
    2.1.1 供试菌株及载体  19
    2.1.2 试剂  19-20
    2.1.3 主要仪器  20-21
    2.1.4 培养基  21
  2.2 方法  21-23
    2.2.1 培养方法  21-22
    2.2.2 PHA 标准曲线的绘制  22
    2.2.3 气相色谱(GC)对 PHA 的定量分析  22
    2.2.4 检测 2P24 的生长曲线及 PHA 的积累曲线  22-23
  2.3 结果  23-25
    2.3.1 PHA 的标准曲线  23
    2.3.2 2P24 在两种碳源下积累的 PHA  23-25
    2.3.3 2P24 的生长曲线及 PHA 的积累情况  25
  2.4 讨论  25-26
  2.5 小结  26-27
第三章构建 2P24 中各调控基因的突变恢复、过表达和双突变菌株  27-37
  3.1 材料  27-29
    3.1.1 供试菌株和载体  27
    3.1.2 试剂  27-28
    3.1.3 仪器设备  28-29
    3.1.4 培养基  29
    3.1.5 引物  29
  3.2 方法  29-32
    3.2.1 大肠杆菌 DH5α感受态细胞的制备  29-30
    3.2.2 大肠杆菌 DH5α的热激转化  30
    3.2.3 菌液中质粒 DNA 的提取  30
    3.2.4 荧光假单胞菌的电击转化  30-31
    3.2.5 三亲杂交构建双突变体  31
    3.2.6 PCR 体系及程序  31-32
  3.3 结果  32-36
    3.3.1 pcoI、gacA、gacS、rpoS 基因恢复补偿菌株的构建  32-34
    3.3.2 pcoI、gacA、gacS、rpoS 基因过表达菌株的构建  34-35
    3.3.3 ΔpcoIΔrpoS、ΔgacAΔrpoS、ΔgacSΔrpoS 双突变体的构建  35-36
  3.4 小结  36-37
第四章在 2P24 中各调控基因对 PHA 积累的影响  37-44
  4.1 材料  37-39
    4.1.1 供试菌株  37-38
    4.1.2 试剂  38
    4.1.3 主要仪器  38-39
    4.1.4 培养基  39
  4.2 方法  39
    4.2.1 培养方法  39
    4.2.2 应用气相色谱(GC)对 PHA 的定量分析  39
  4.3 结果  39-42
    4.3.1 荧光假单胞菌 2P24 中各调控基因缺失对 PHA 积累情况的影响  39-40
    4.3.2 调控基因 gacA 对 PHA 积累的影响  40-41
    4.3.3 调控基因 gacS 对 PHA 积累的影响  41-42
    4.3.4 调控基因 rpoS 对 PHA 积累的影响  42
  4.4 讨论  42-43
  4.5 小结  43-44
第五章 PHA 合成酶基因转录报告载体的构建  44-51
  5.1 材料  44-46
    5.1.1 供试菌株和载体  44
    5.1.2 引物  44-45
    5.1.3 培养基  45
    5.1.4 试剂  45
    5.1.5 仪器  45-46
  5.2 方法  46-47
    5.2.1 大肠杆菌 DH5α感受态细胞制备  46
    5.2.2 大肠杆菌的热激转化  46
    5.2.3 菌液中质粒 DNA 的提取  46
    5.2.4 荧光假单胞菌的电击转化  46-47
    5.2.5 从琼脂糖凝胶中回收 DNA 片段  47
  5.3 结果  47-50
    5.3.1 PHA 合成酶基因 phaC1 启动子的克隆  47
    5.3.2 phaC1 基因转录报告载体的构建  47-49
    5.3.3 报告载体 p970Km-pphaC1 的电击转化  49-50
  5.4 小结  50-51
第六章结论  51-52
第七章展望  52-53
参考文献  53-58
致谢  58-60
攻读学位期间所取得的相关科研成果  60

Quorum sensing、GacS/GacA和RpoS对荧光假单胞菌2P24胞内合成聚羟基脂肪酸酯的调控

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