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丛枝菌根特异AsPT1与AsPT4基因上游激活元件功能分析

作　者: 刘丰川
导　师: 赵斌
学　校: 华中农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 丛枝菌根 磷转运基因 农杆菌K599 模体
分类号: Q93
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


丛枝菌根(Arbuscular mycorrhiza, AM)共生是一种广泛存在于陆生植物中的一种共生方式,并且能够与80%以上的陆生植物形成共生关系,对植物N、P、Fe、Cu等元素的吸收均具有促进作用,尤其是在P元素吸收方面更为突出,化石分析表明这种共生关系在4.6亿年前就曾存在。当植物与菌根真菌形成共生后,植物便获得了一种新的P吸收途径即菌根真菌途径又称间接吸收途径,通过该途径,植物不仅提高了P吸收效率,同时也扩大了植物在土壤中P吸收的范围。并且研究证实,菌根吸收途径在菌根植物所有P吸收途径中起关键作用(Smith eta1.,2003,2004)。虽然这种共生关系的作用已被广为接受,然而对这种互利共生关系的分子机制并不清楚,本课题致力于研究与菌根有关的磷转运基因的表达调控分析。在实验室已分离的六种P转运基因的基础上,通过表达模式分析,最终分离到两种菌根特异的P转运基因即AsPT1和AsPT4,根据系统进化树分析结果表明,二者均属于Phl磷转运家族；RT-PCR和RT-qPCR分析证实AsPT1和AsPT4基因均为菌根特异型P转运基因,即只有当植物与菌根真菌共生后才能表达。利用生物信息学方法对AsPT1和AsPT4基因的启动子区域进行已知的motif查找定位,以及通过FootPrinter2.0对二者启动子区域进行motif预测分析。通过PCR的方法对启动子进行逐步截断,以及over-lap PCR的方法对motif进行特异敲除,构建以GUS为报告基因的pBI121穿梭载体,利用发根农杆菌K599介导的方法,进行植物转化,转化植株与Glomus intraradices进行共培养一个月,通过TB染色,GUS染色以及GUS酶活检测最终得出结果如下：1、MYCS作为已知的菌根特异的磷转运基因的顺式作用元件,在豆科植物紫云英菌根特异的磷转运基因AsPT1和AsPT4的调控中也具有重要的调控作用。2、AsPT1基因的调控表达较为复杂,存在于其上的TGTT-motitf、 AAAA-motif、TAAT-motif以及MYCS等元件具有协调调节作用,存在正负两种调控方式。TGTT-motif对AsPT1P的驱动活力具有显著调节作用。3、AsPT4基因的调控表达较为简单,存在其上的TAAT-motif及TAAC-motif对AsPT4P驱动活力具有正向调控作用,可能作为一种增强子元件来发挥作用。综上所述,TGTT-motif, AAAA-motif, TAAT-motif及TAAC-motif对豆科植物紫云英中菌根特异的磷转运基因AsPTl和AsPT4具有较为明显的调控作用,而通过直系同源的菌根特异的磷转运基因的启动子序列分析表明,这些元件广泛存在于菌根特异的磷转运基因启动子中,他们可能与MYCS元件类似,具有广泛的调节作用。

全文目录


目录  4-6
摘要  6-8
Abstract  8-10
1 前言  10-18
  1.1 丛枝菌根共生  11-13
    1.1.1 丛枝菌根真菌  11-12
    1.1.2 菌根真菌共生体的形成  12-13
  1.2 植物获取土壤中P的方式  13-14
    1.2.1 直接吸收途径  13-14
    1.2.2 间接吸收途径  14
  1.3 磷转运蛋白(Phosphate transporters PiTs)  14-15
    1.3.1 直接吸收途径中的PiTs  14
    1.3.2 间接吸收途径中的PiTs  14-15
  1.4 顺式作用元件(CREs)与转录因子(TFs)筛选  15-16
    1.4.1 顺式作用元件  15-16
    1.4.2 转录因子  16
  1.5 本研究的主要内容和技术路线  16-18
    1.5.1 主要研究内容  16-17
    1.5.2 实验技术路线  17-18
2 材料和方法  18-33
  2.1 实验材料  18-23
    2.1.1 供试土壤  18
    2.1.2 供试植物及AM真菌  18
    2.1.3 供试试剂  18-22
    2.1.4 主要仪器  22-23
  2.2 方法  23-33
    2.2.1 AsPT全长的克隆  23
    2.2.2 盆栽试验  23
    2.2.3 植物总RNA的抽提  23-24
    2.2.4 TA克隆及测序分析  24-26
    2.2.5 RT-PCR and Real-Time PCR  26-27
    2.2.6 生物信息学分析  27-28
    2.2.7 突变体系载体构建  28
    2.2.8 植物转化  28-29
    2.2.9 发根农杆菌K599介导的紫云英转化  29-30
    2.2.10 转化根中总蛋白提取  30
    2.2.11 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量  30-31
    2.2.12 GUS酶活测定  31-33
3 结果与分析  33-50
  3.1 Pht1家族AsPT1和AsPT4基因表达模式分析  33-34
  3.2 AsPT基因系统进化分析  34-35
  3.3 AsPT1和AsPT4启动子活性分析  35-37
  3.4 AsPT基因启动子的生物信息学分析  37-38
  3.5 AsPT1和AsPT4启动子的EMSA实验  38-39
  3.6 AsPT1P和AsPT4P突变体系构建  39-41
  3.7 AsPT1和AsPT4突变体系侵染率  41-43
  3.8 AsPT1和AsPT4突变体系GUS检测结果  43-50
    3.8.1 AsPT1P突变体系GUS染色结果  43-46
    3.8.3 AsPT突变体系GUS根段统计结果  46-47
    3.8.4 AsPT1P突变体系GUS酶活检测结果  47-48
    3.8.5 AsPT4P突变体系GUS酶活检测结果  48-49
    3.8.6 MYCS元件的分析结果  49-50
4 讨论  50-54
  4.1 AsPT4启动子中保守元件的功能分析  50-51
  4.2 AsPT1启动子中保守元件的分析  51-53
  4.3 菌根特异的磷转运基因启动子上保守元件的分布分析  53-54
5 参考文献  54-59
附录  59-64
发表文章  64-65
致谢  65

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中图分类: > 生物科学 > 微生物学
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