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细菌苏氨酸脱水酶的进化研究

作　者: 于雪飞
导　师: 王小元
学　校: 江南大学
专　业: 发酵工程
关键词: 苏氨酸脱水酶类ACT亚结构域分子进化抗异亮氨酸反馈抑制
分类号: Q93
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

苏氨酸脱水酶（Threonine dehydratase, TD）可催化苏氨酸脱氢生成2-酮丁酸，在自然界以两种形式存在：合成代谢苏氨酸脱水酶（Biosynthetic threonine dehydratase, BTD）和分解代谢苏氨酸脱水酶（Catabolic threonine dehydratase, CTD）。两者具有不同的蛋白质结构和生物化学性质，并参与不同的代谢途径。BTD可进一步分为两种类型：BTD1和BTD2，两者参与相同的代谢途径，但蛋白质结构和生物化学性质有所不同。CTD、BTD1和BTD2相同的功能说明三者可能存在一定的进化关系，而它们结构、性质和代谢途径的差异又说明三者对生物体适应环境有不同的意义。目前针对CTD、BTD1和BTD2的结构和性质已有大量研究，但CTD、BTD1与BTD2的进化关系、进化途径以及进化的意义目前尚不清楚。本文结合生物信息学和分子生物学等方法系统分析了三者的进化关系、进化途径及进化推动力，提出了TD可能的进化模型。并进一步通过直接去除BTD类ACT亚结构域的方法，实现了BTD抗异亮氨酸反馈抑制，具有一定的应用指导意义。主要研究结果如下：（1）通过比对来源于328个属的CTD和来源于546个属的BTD的序列特征，以及StCTD（2GN2）与EcBTD2（1TDJ）的结构特征，发现CTD与BTD的序列特征与结构特征一致，说明虽然CTD与BTD参与不同的代谢途径，但CTD与BTD为来源于同一祖先的同源蛋白质，而非功能相同的类似蛋白质。（2）从Proteobacteria、Firmicutes和Actinobacteria三大菌门中以分类学为标准挑选82个菌株，并构建TD蛋白质序列的进化树模型。分析发现：CTD与BTD2各只分布于一个组群，而BTD1则分布于两个组群（BTD1-A和BTD1-B），且组群BTD1-A与BTD2紧邻。结果说明，BTD1编码基因发生过复制，BTD1-A与BTD2的亲缘关系较BTD1-B紧密。（3）提取82个基因组的16s rDNA序列构建进化树模型，并分析CTD、BTD1及BTD2的分布规律。分析发现CTD广泛存在于三大菌门， BTD1广泛存在于除-proteobacteria外的三大菌门，但除8个基因组同时含有BTD1-A和BTD1-B外，其余基因组只含有BTD1-A或BTD1-B；BTD2只分布于Proteobacteria。说明CTD可能出现最早，BTD1编码基因复制后发生丢失，BTD2出现最晚产生于Proteobacteria中。（4）在Escherichia coli中过量表达3个CTD、2个BTD1-A、2个BTD1-B和2个BTD2编码基因，构建9个TD表达菌株，研究TD的进化推动力。从E.coli重组菌中纯化9种不同的TD，比较9中TD在不同pH和不同温度下的活力及稳定性。结果发现：BTD1最稳定，但BTD2的酶活力最高。说明类ACT亚结构域对TD的稳定性和易变性有重要影响，可推动TD的进化。（5）去除Corynebacteriumglutamicum BTD1及E. coli BTD2的类ACT亚结构域，并在E. coli中过量表达两个突变酶，构建2个重组表达菌株。从E. coli重组菌中纯化2种突变酶，测定其酶活力及抗异亮氨酸反馈抑制能力。结果发现，突变酶活力降低，但不再受异亮氨酸反馈抑制。说明类ACT亚结构域的去除可实现BTD抗异亮氨酸反馈抑制。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-9
第一章绪论  9-16
  1.1 BTD 的结构与变构性质  9-12
    1.1.1 BTD2 的结构与变构性质  9-11
    1.1.2 BTD1 的结构与变构性质  11-12
    1.1.3 类 ACT 亚结构域  12
  1.2 CTD 的结构与性质  12
  1.3 酶的进化途径  12-14
    1.3.1 基因复制  13
    1.3.2 基因延伸  13-14
    1.3.3 基因融合  14
  1.4 TD 的应用  14-15
  1.5 立题背景及意义  15
  1.6 课题的主要研究内容  15-16
第二章材料与方法  16-23
  2.1 CTD 与 BTD 序列特征及结构特征的比对  16
    2.1.1 CTD 与 BTD 的序列特征比对  16
    2.1.2 CTD 与 BTD 的结构特征比对  16
  2.2 TD 蛋白质序列进化树模型及菌种 16s rDNA 序列进化树模型的构建  16-17
    2.2.1 用于进化树模型构建的菌种选定  16-17
    2.2.2 TD 蛋白质序列进化树模型的构建  17
    2.2.3 16s rDNA 序列进化树模型的构建  17
  2.3 分子操作的实验材料及仪器设备  17-20
    2.3.1 菌株、质粒、引物和培养条件  17-19
    2.3.2 主要试剂  19-20
    2.3.3 主要仪器设备  20
  2.4 分子生物学的相关操作  20-21
    2.4.1 基因组 DNA 及质粒 DNA 的提取  20-21
    2.4.2 PCR 反应  21
    2.4.3 质粒和 DNA 片段的酶切连接  21
  2.5 TD 的表达与纯化  21-22
    2.5.1 TD 的表达  21
    2.5.2 TD 的纯化  21-22
  2.6 TD 酶学性质的测定  22-23
    2.6.1 酶活力的测定方法  22
    2.6.2 酶热力学稳定性的测定方法  22
    2.6.3 TD 在不同浓度异亮氨酸环境下的酶活力测定方法  22-23
第三章结果与讨论  23-43
  3.1 CTD 与 BTD 为来源相同祖先的同源蛋白质  23-25
    3.1.1 CTD 与 BTD 的序列特征一致  23-24
    3.1.2 CTD 与 BTD 的结构特征一致  24-25
  3.2 TD 进化过程中经历基因融合、复制、延伸和丢失  25-34
    3.2.1 TD 进化过程中经历基因融合和基因复制  26-31
    3.2.2 TD 进化过程中经历基因延伸和基因丢失  31-34
  3.3 酶的稳定性及易变性可能推动 TD 进化  34-38
    3.3.1 TD 重组表达菌株的构建  34-35
    3.3.2 TD 的表达与纯化  35-36
    3.3.3 酶的稳定性及易变性可能推动 TD 进化  36-38
  3.4 TD 的进化模型  38-39
  3.6 类 ACT 亚结构域的去除可解除异亮氨酸对 BTD 的反馈抑制  39-43
    3.6.1 EcBTD2M和 CgBTD1M表达载体的构建  39-40
    3.6.2 EcBTD2M及 CgBTD1M的表达与纯化  40-41
    3.6.3 类 ACT 亚结构域的去除可解除异亮氨酸对 BTD 的反馈抑制  41-43
主要结论与展望  43-45
致谢  45-46
参考文献  46-51
附录 1 用于 TD 蛋白质序列进化树模型构建的代表菌株及 TD  51-56
附录 2 作者在攻读硕士学位期间发表的论文  56

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