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玫瑰孢链霉菌代谢达托霉素及豪氏变形杆菌铜抗性的蛋白质组学研究

作　者: 叶驰名
导　师: 卢英华；吴意珣
学　校: 厦门大学
专　业: 生物化工
关键词: 蛋白质组学玫瑰孢链霉菌达托霉素豪氏变形杆菌抗铜机制
分类号: Q936
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

蛋白质组学作为一门新兴学科,其发展迅速、应用领域越来越广泛。本研究以蛋白质组学技术为核心手段,对玫瑰孢链霉菌生产达托霉素的机理及豪氏变形杆菌的抗铜机制展开研究,试图从蛋白调控水平阐释其机理。经研究发现玫瑰孢链霉菌生产达托霉素需要前体添加物的刺激,前体是达托霉素合成的必要条件。本文针对以癸酸和癸酸钠为前体,其中前者是目前很多报道中很常见的前体,而后者则尚未任何文献有相关报道。实验结果表明癸酸钠作为前体添加的效果要明显优于癸酸,这主要是由于其具有较好的水溶性,较易被细胞吸收利用。本研究首次从蛋白入手对玫瑰孢链霉菌进行分析,并阐释其代谢机理。正因为前体对达托霉素的生产起着至关重要的作用,为了进一步了解前体刺激达托霉素合成的机理,本研究试图用蛋白质组学技术加以说明。实验中,对添加前体和不添加前体两组比较分析其一维蛋白质电泳(SDS-PAGE)、串联质谱(MALDI-TOF-MS/MS)和液质联用质谱(LC-MS/MS)的结果。在一维蛋白电泳偶联质谱分析结果中鉴定出假定调节蛋白(Putative regulatory protein)、鸟苷五磷酸合成酶(Guanosine pentaphosphate synthetase)、多核苷酸磷酸化酶(Polyribonucleotide nucleotidyltransferase phosphorylase, PNPase)、假定三肽氨基肽酶(Putative secreted tripeptidylamino peptidase)、假定双组份系统组氨酸激酶(Putative two-component system histidine kinase)这五个蛋白,它们与达托霉素的合成及分泌有密切关联。随后,本研究采取LC-MS/MS分析前体影响下的玫瑰孢链霉菌全蛋白质组学,在加前体和不加前体的条件下分别鉴定出601和935个蛋白,其中差异蛋白数为357和691。实验中对这些蛋白进行了分子量和等电点的区段划分,并且模拟了双向电泳图谱。根据功能作用的区别,差异蛋白被分成了14个类别,其中转运及膜功能蛋白(transport/membrane function)差别最大,其在添加前体实验组中占12.4%,但在不添加前体实验组中只占了5.2%。最后,结合达托霉素合成基因簇信息,在差异蛋白中发现了5类与达托霉素合成相关的蛋白,分别为抗性蛋白(resistance protein)、 ATP结合盒式转运蛋白(ATP-binding cassette transporter, ABC transporter)、酰基载体蛋白(acyl carrierprotein)、甲基转移酶(methyltransferase)和调节蛋白(regulator),而且在加前体条件下较不加前体多。但在这些蛋白中并没有直接合成达托霉素的多肽合成酶,根据结果推测前体是通过影响达托霉素合成调节蛋白来促进达托霉素的合成。另外,本文运用一维蛋白电泳、二维蛋白电泳及LC-MS/MS阐释豪氏变形杆菌的抗铜机制。实验发现,铜的添加使得豪氏变形杆菌的膜蛋白变多,这可能与建立抗铜性的RND系统关联。另外,在豪氏变形杆菌中存在二硫键异构酶,它能修复铜破坏的二硫键,使细胞能持续存活。而且铜使得豪氏变形杆菌的外膜通道蛋白表达受到抑制,从而减少铜向细胞内的运输,维持细胞内铜含量的正常水平,使豪氏变形杆菌在高浓度铜条件下依然能存活,但因为其泳动能力下降,故抗铜机制亦能利用在抑制其致病性上。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-14
第一章文献综述  14-35
  1.1 蛋白质组学简介  14-20
    1.1.1 色谱技术  14-15
    1.1.2 电泳技术  15-16
    1.1.3 质谱技术  16-20
    1.1.4 蛋白质组学的近期发展  20
  1.2 玫瑰孢链霉菌简介  20-22
    1.2.1 菌种来源及性状  20-21
    1.2.2 玫瑰孢链霉菌生产达托霉素的研究现状  21-22
  1.3 达托霉素简介  22-30
    1.3.1 达托霉素的结构及理化性质  22-24
    1.3.2 达托霉素的作用机理  24
    1.3.3 达托霉素的合成机制  24-27
    1.3.4 达托霉素的临床研究进展  27-29
    1.3.5 达托霉素的应用前景  29-30
  1.4 豪氏变形杆菌简介  30-31
    1.4.1 变形杆菌的性状  30
    1.4.2 豪氏变形杆菌的分类及应用  30-31
  1.5 微生物对金属铜的应激  31-33
    1.5.1 微生物的铜抗性  31-32
    1.5.2 微生物中常见的铜传输模型  32-33
  1.6 课题研究内容及意义  33-35
    1.6.1 主要内容  33
    1.6.2 研究意义  33-35
      1.6.2.1 达托霉素生产机理研究的意义  33-34
      1.6.2.2 豪氏变形杆菌抗铜机制研究的意义  34-35
第二章前体对达托霉素生产影响的研究  35-50
  2.1 菌种来源  35
  2.2 实验试剂及仪器  35-38
  2.3 实验方法  38-45
    2.3.1 培养基组成及微生物的培养  38-39
      2.3.1.1 培养基组成  38
      2.3.1.2 微生物的培养  38-39
    2.3.2 发酵参数的检测  39-40
      2.3.2.1 生物量  39
      2.3.2.2 原糖  39-40
    2.3.3 达托霉素的检测  40-41
    2.3.4 蛋白的提取  41-42
      2.3.4.1 细胞破碎  41-42
      2.3.4.2 蛋白浓度的测定  42
    2.3.5 一维蛋白电泳分析  42-44
      2.3.5.1 电泳试剂配方  42-43
      2.3.5.2 电泳分析流程  43-44
    2.3.6 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS/MS)分析  44-45
      2.3.6.1 胶上酶解  44-45
      2.3.6.2 质谱分析  45
  2.4 结果与讨论  45-49
    2.4.1 前体对达托霉素发酵的影响  45-46
    2.4.2 前体影响的蛋白电泳分析  46-47
    2.4.3 前体影响的质谱分析  47-49
  2.5 本章小结  49-50
第三章前体对达托霉素影响的全蛋白质组分析  50-64
  3.1 菌种来源  50
  3.2 实验试剂及仪器  50-51
  3.3 实验方法  51-54
    3.3.1 微生物的培养及培养基组成  51
    3.3.2 发酵参数及达托霉素的检测  51
    3.3.3 蛋白的提取  51
    3.3.4 双向电泳分析  51-53
      3.3.4.1 电泳试剂配方  51-52
      3.3.4.2 双向电泳分析流程  52-53
    3.3.5 液相色谱偶联质谱(LC-MS/MS)分析  53-54
    3.3.6 蛋白质的数据库比对及功能分类  54
  3.4 结果与讨论  54-62
    3.4.1 LC-MS/MS与双向电泳分析对比  54-58
    3.4.2 蛋白质组的功能分类  58-60
    3.4.3 达托霉素合成相关蛋白的分析  60-62
  3.5 本章小结  62-64
第四章豪氏变形杆菌抗铜机制的研究  64-82
  4.1 菌种来源  64
  4.2 实验试剂及仪器  64-65
  4.3 实验方法  65-68
    4.3.1 微生物的培养及培养基组成  65
      4.3.1.1 培养基组成  65
      4.3.1.2 微生物的培养  65
    4.3.2 抑菌实验  65-66
    4.3.3 生物量及多铜氧化酶酶活的测定  66-67
      4.3.3.1 生物量的测定  66
      4.3.3.2 多铜氧化酶酶活的测定  66-67
    4.3.4 蛋白的提取  67
      4.3.4.1 细胞破碎  67
      4.3.4.2 蛋白浓度的测定  67
    4.3.5 一维蛋白电泳分析  67
    4.3.6 二维蛋白电泳分析  67
    4.3.7 MALDI-TOF-MS/MS分析  67-68
    4.3.8 LC-MS/MS分析  68
    4.3.9 蛋白质的数据库比对及功能分类  68
  4.4 结果与讨论  68-80
    4.4.1 铜离子对豪氏变形杆菌生长及多铜氧化酶生产的影响  68-70
    4.4.2 一维蛋白电泳及二维蛋白电泳分析  70-75
    4.4.3 LC-MS/MS分析  75-79
      4.4.3.1 理化性质分析  75-76
      4.4.3.2 蛋白功能分类  76-79
    4.4.4 豪氏变形杆菌抗铜机制的探讨  79-80
  4.5 本章小结  80-82
第五章结论与展望  82-84
  5.1 结论  82-83
  5.2 课题展望  83-84
参考文献  84-93
在读期间发表论文及所获荣誉  93-94
致谢  94-95

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