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高产α-乙酰乳酸脱羧酶重组枯草芽孢杆菌的构建及其发酵优化

作　者: 李静静
导　师: 饶志明
学　校: 江南大学
专　业: 微生物学
关键词: α-乙酰乳酸脱羧酶菌种筛选重组大肠杆菌重组枯草芽孢杆菌酶学性质发酵优化
分类号: TQ925
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

α-乙酰乳酸脱羧酶(α-acetolactate decarboxylase，α-ALDC，EC.4.1.1.5)能催化双乙酰(diacetyl)的前体物α-乙酰乳酸快速脱羧形成乙偶姻，避免双乙酰的生成，在啤酒等食品发酵行业具有广泛应用。本研究从自然界分离筛选出两株α-ALDC生产菌，克隆α-ALDC基因并构建重组大肠杆菌和重组枯草芽孢杆菌进行过量表达，研究了枯草芽孢杆菌表达体系所得纯酶的酶学性质，优化放大了重组枯草芽孢杆菌的发酵产酶条件，最终达到高效产酶且更适合工业应用的目的。从自然界分离得到80株V.P试验阳性菌，经平板初步筛选和摇瓶发酵，得到15株产α-ALDC菌株。进一步复筛，得到两株高产α-ALDC菌株，经生理生化鉴定及16S rRNA序列分析，确定为Staphyloccocus aureus L3-15和Bacillus subtilis L5-20。构建重组大肠杆菌，表达了两个不同来源的α-ALDC基因。结果显示，来源于S.aureus L3-15的基因Saald大小为705bp，构建的重组大肠杆菌E. coliBL21/pET-28a(+)-Saald表达的α-ALDC总酶活为22.3U/mL，比出发菌提高了52倍；来源于B. subtilis L5-20的基因BsalsD大小为768bp，构建的重组大肠杆菌E. coliBL21/pET-28a(+)-BsalsD表达的α-ALDC总酶活为18.5U/mL，比出发菌提高了53倍。在两个不同来源的α-ALDC基因下游序列插入6个His编码基因，并与载体pMA5相连，构建重组载体pMA5-Saald和pMA5-BsalsD，分别转化至B. subtilis WB600中构建重组枯草芽孢杆菌。结果表明，Saald和BsalsD基因都可以在B. subtilis WB600中得到成功表达，Saald基因表达的重组蛋白SaALDC总酶活36.0U/mL，而BsalsD基因表达的BsALDC总酶活为27.0U/mL，分别比其相应的出发菌提高了也约80倍。重组枯草芽孢杆菌发酵所得粗酶液经Ni-NTA纯化，得到的SaALDC纯酶液，比酶活为469.5U/mg，最适pH为6.0，最适反应温度为35℃，Km为17.7μmol/L，Vmax为2.06mmol/(L·min)；得到的BsALDC纯酶液，比酶活为272.3U/mg，最适pH为6.0，最适反应温度为25℃，Km为29.04μmol/L，Vmax为2.82mmol/(L·min)。相比SaALDC而言，BsALDC表现出较好的温度适应性，更具工业应用前景。优化了重组枯草芽孢杆菌B. subtilis WB600/pMA5-BsalsD的发酵产酶培养基及培养条件。获得的最佳培养基配方为：甘油52g/L、大豆蛋白胨12g/L、磷酸盐25mmol/L、MgSO4·7H2O4.0mmol/L、尿素3g/L，NiSO4·6H2O1.5mmol/L，玉米浆15g/L，NaCl5g/L。最佳培养条件为：培养温度37℃，培养基初始pH6.5~7.0，接种量6%，摇床转速200r/min。利用5L发酵罐发酵培养重组枯草芽孢杆菌，α-ALDC酶活在48h达到105.8U/mL，其中胞内、胞外α-ALDC酶活分别为54.3U/mL和51.5U/mL。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-6
目录  6-8
第一章绪论  8-16
  1.1 α-乙酰乳酸脱羧酶概述  8
    1.1.1 α-乙酰乳酸脱羧酶及其特性  8
    1.1.2 α-ALDC 的作用机理  8
  1.2 α-ALDC 与啤酒工业  8-10
    1.2.1 双乙酰的生成  8-9
    1.2.2 双乙酰的控制  9-10
    1.2.3 α-ALDC 在啤酒发酵中的应用  10
  1.3 α-ALDC 的国内外研究现状  10-15
    1.3.1 ALDC 产生菌及其筛选  10-11
    1.3.2 α-ALDC 的分子生物学研究  11-12
    1.3.3 ALDC 基因的克隆表达研究  12-13
    1.3.4 α-ALDC 的酶学性质研究  13-15
  1.4 本课题的研究意义及主要研究内容  15-16
    1.4.1 研究意义  15
    1.4.2 主要研究内容  15-16
第二章材料与方法  16-25
  2.1 实验材料  16-19
    2.1.1 菌株与质粒  16-17
    2.1.2 引物设计  17
    2.1.3 主要仪器  17-18
    2.1.4 主要试剂  18
    2.1.5 培养基及培养条件  18
    2.1.6 主要试剂配制  18-19
  2.2 实验方法  19-25
    2.2.1 α-ALDC 产生菌的筛选与鉴定  19
    2.2.2 S. aureus α-ALDC 基因 Saald 和 B. subtilis α-ALDC 基因 BsalsD 的克隆  19
    2.2.3 重组质粒 pET-28a(+)-Saald 与 pET-28a(+)-BsalsD 的构建  19-20
    2.2.4 重组大肠杆菌的构建及其诱导表达  20
    2.2.5 重组质粒 pMA5-Saald 与 pMA5-BsalsD 的构建  20-21
    2.2.6 重组枯草芽孢杆菌的构建与表达  21
    2.2.7 重组α-ALDC 的纯化及酶学性质研究  21-22
    2.2.8 重组枯草芽孢杆菌产酶发酵研究  22
    2.2.9 5 L 发酵罐中重组枯草芽孢杆菌的发酵研究  22-23
    2.2.10 分析及检测方法  23-25
第三章结果与讨论  25-52
  3.1 α-ALDC 产生菌的筛选与鉴定  25-28
    3.1.1 α-ALDC 产生菌的筛选  25
    3.1.2 菌株 L 3-15 和 L 5-20 的形态学特征  25-26
    3.1.3 菌株 L 3-15 和 L 5-20 的生理生化反应  26-27
    3.1.4 菌株 L3-15 和 L5-20 的 16S rRNA 序列分析  27-28
  3.2 重组大肠杆菌的构建及其诱导表达研究  28-32
    3.2.1 α-ALDC 基因的克隆与分析  28-29
    3.2.2 重组质粒 pET-28a(+)-Saald 和 pET-28a(+)-BsalsD 的构建及分析  29-30
    3.2.3 重组大肠杆菌的构建及诱导表达  30-32
  3.3 重组枯草芽孢杆菌的构建及其表达  32-36
    3.3.1 α-ALDC 基因的克隆与分析  32-33
    3.3.2 重组质粒 pMA5-Saald 和 pMA5-BsalsD 的构建  33-34
    3.3.3 重组枯草芽孢杆菌的构建及表达  34-36
  3.4 重组枯草芽孢杆菌 SaALDC 和 BsALDC 的纯化及酶学性质研究比较  36-41
    3.4.1 重组α-ALDC 的纯化  36-37
    3.4.2 重组 SaALDC 和 BsALDC 最适 pH 及 pH 稳定性的比较研究  37-38
    3.4.3 重组 SaALDC 和 BsALDC 最适反应温度及温度稳定性的比较研究  38-39
    3.4.4 不同金属离子以及 EDTA 对酶活的影响  39-40
    3.4.5 Km值及Vmax的测定  40-41
  3.5 重组枯草芽孢杆菌的发酵产酶优化  41-52
    3.5.1 产酶发酵培养基中的菌体生长及产酶特征曲线  41-42
    3.5.2 重组枯草芽孢杆菌发酵培养基的初步优化  42-48
    3.5.3 重组枯草芽孢杆菌发酵条件的初步优化  48-51
    3.5.4 5 L 发酵罐中重组枯草芽孢杆菌的发酵产酶研究  51-52
主要结论与展望  52-54
  主要结论  52-53
  展望  53-54
致谢  54-55
参考文献  55-59
附录一：作者在攻读硕士学位期间发表的论文  59-60
附录二：缩略词表  60

高产α-乙酰乳酸脱羧酶重组枯草芽孢杆菌的构建及其发酵优化

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