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番茄DEAD-box解旋酶基因SlDEAH1的克隆与功能研究

作　者: 张建苓
导　师: 胡宗利
学　校: 重庆大学
专　业: 生物学
关键词: 番茄 SlDEAH1 RNAi表达载体构建表达模式及胁迫与激素处理分析表型及统计学分析
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

解旋酶是一类在生物体内普遍存在的蛋白酶，它能够利用NTP（主要为ATP）水解获得能量并促进双链DNA（DNA解旋酶）或RNA（RNA解旋酶）的解旋，这种庞大的蛋白酶类广泛存在于病毒、人类等几乎所有的原核生物和真核生物中。研究表明，DEAD-box解旋酶在基本的细胞过程中起到了非常重要的作用，参与了从细菌到真核生物细胞几乎所有的生物过程，包括RNA代谢、基因表达调控、核质运输、激素信号响应、核糖体发生和组装及抗非生物逆境反应等重要生命活动。此外，DEAD-box解旋酶还可以作为普通的分子伴侣在RNA折叠及RNA-蛋白质复合体加工等方面也起到了重要作用。番茄是研究果实成熟的模式植物，同时，其生长周期较短及全基因组测序的完成也为研究番茄中基因功能提供了方便。本研究根据已经报道的拟南芥、玉米中的DEAD-box蛋白，通过同源比对，在NCBI数据库中筛选得到了一个DEAD-box同源蛋白，命名为SlDEAH1。生物信息学分析结果表明其属于DEAD-box解旋酶家族DEAH类群。但到目前为止还未见番茄中有关DEAD-box解旋酶的研究和报道，因此，番茄SlDEAH1基因的具体功能还不清楚，为了进一步研究SlDEAH1基因在番茄生长发育、抗逆性、基因表达调控及参与果实成熟等方面可能发挥的重要作用，本研究的主要内容及获得的主要结果如下：1、根据已经报道的拟南芥、玉米等的DEAD-box蛋白，通过同源比对，在NCBI组数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中筛选得到了一个DEAD-box同源蛋白，命名为SlDEAH1（登录号：XP₀04248028），根据其基因序列（登录号：XM₀04247980）设计特异基因全长扩增引物，以野生型（WT）番茄AC++果实B时期cDNA为模板，应用RT-PCR方法从野生型番茄（AC++）中克隆得到了该基因的全长序列，经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，扩增出一条约为2300bp的目的条带，与预测条带大小一致。经PCR扩增片段回收纯化、克隆、测序后证明该片段为目的基因片段。2、根据所获得的序列对SlDEAH1做了生物信息学分析，序列分析表明：该cDNA全长2335bp，包括2073bp的开放阅读框，编码690个氨基酸残基。二级结构预测结果表明SlDEAH1蛋白存在42.46%的α螺旋，34.35%的无规则卷曲，16.38%的延伸链，6.81%的β折叠。亚细胞结构定位预测SlDEAH1蛋白位于质膜。同源比对结果表明该蛋白具有9个非常保守的结构基序，对于ATP结合、水解及RNA结合的解旋酶活性是必需的。保守结构域搜索结果表明该蛋白属于DEAD-box解旋酶家族。3、采用双酶切方法，利用pHINIBAL中间载体构建了SlDEAH1的RNAi表达载体pBIN19-iSlDEAH1。4、采用农杆菌介导的方法将构建的RNAi表达载体pBIN19-iSlDEAH1导入野生型（WT）番茄AC++的子叶外植体中，经抗性筛选、NPT II检测及qRT-PCR基因沉默效率检测获得沉默效率很高的阳性转基因番茄株系。5、以番茄管家基因CAC（登录号：SGN-U314153）作为内参，采用实时定量PCR方法对SlDEAH1在野生型番茄AC++、突变体Nr及rin不同组织中进行组织特异性表达模式研究，结果表明：SlDEAH1在野生型（WT）萼片、成熟叶以及老叶中表达量较高，在B+4和B+7时期果实中的表达量最高，并且在果实的发育和成熟过程中，该基因表达量有一个明显的上升趋势，在突变体Nr和rin中，从B时期开始SlDEAH1的表达量均依次下降。6、采用实时定量PCR方法研究SlDEAH1在高温（40℃）、低温（4℃）、脱水、伤害、盐等胁迫条件下的表达，结果表明：高温（40℃）、低温（4℃）、脱水、伤害、盐等胁迫不同程度的诱导了SlDEAH1的表达，但在根中该基因的表达受盐胁迫抑制。7、通过实时定量PCR方法，研究ABA、ACC、GA3、IAA、meJA、ZT等激素对SlDEAH表达的影响。结果表明ABA、ACC、GA3、IAA、meJA和ZT均不同程度的诱导了SlDEAH1基因的表达，其中对SlDEAH1基因的表达诱导最明显的是ABA。8、表型分析及统计学分析结果表明SlDEAH1基因在番茄叶片生长发育过程中发挥重要功能，并可能在果实生长发育过程中起到一定作用，但该基因对果实成熟没有影响。所有结果表明SlDEAH1基因编码一个功能性的DEAD-box RNA解旋酶蛋白，在相应激素、生物非生物胁迫及番茄叶片生长发育起到重要作用，并可能在番茄果实生长发育中起到一定作用。

全文目录

摘要  3-5
ABSTRACT  5-8
目录  8-11
缩略词表  11-13
1 绪论  13-31
  1.1 解旋酶研究进展  13-17
    1.1.1 解旋酶的定义及分类  13-14
    1.1.2 解旋酶的结构  14-16
    1.1.3 解旋酶的作用机制  16-17
  1.2 DEAD-BOX 解旋酶的研究进展  17-26
    1.2.1 DEAD-box 解旋酶的结构  17-19
    1.2.2 DEAD-box 解旋酶保守基序间特异的相互作用  19-22
    1.2.3 DEAD-box 解旋酶的酶学特性  22-25
    1.2.4 DEAD-box 解旋酶的功能及研究现状  25-26
  1.3 课题的提出和研究意义  26-27
  1.4 课题研究的内容和技术路线  27-31
    1.4.1 课题研究的主要内容  27-28
    1.4.2 课题研究的技术路线  28-31
2 材料与方法  31-53
  2.1 材料  31-36
    2.1.1 植物材料  31
    2.1.2 菌株与质粒载体  31
    2.1.3 主要的仪器和设备  31-32
    2.1.4 常用生化试剂及试剂盒  32
    2.1.5 各种培养基及主要试剂的配制  32-36
  2.2 实验方法  36-53
    2.2.1 本研究所使用的分子生物学技术  36-39
    2.2.2 SlDEAH1 基因序列的获得及研究所需引物的设计  39-40
    2.2.3 SlDEAH1 基因的生物信息学分析  40
    2.2.4 番茄各样品总 RNA 的提取和 cDNA 的合成  40-43
    2.2.5 SlDEAH1 基因 CDS 全长序列克隆  43-44
    2.2.6 SlDEAH1 基因的组织特异性表达模式分析  44
    2.2.7 SlDEAH1 基因的胁迫处理表达分析  44-45
    2.2.8 SlDEAH1 基因的激素处理表达分析  45
    2.2.9 SlDEAH1 基因的沉默载体构建  45-50
    2.2.10 SlDEAH1 基因的沉默载体转化番茄子叶外植体  50-52
    2.2.11 SlDEAH1 基因的沉默转基因番茄表型观察及统计学分析  52-53
3 结果与分析  53-67
  3.1 SlDEAH1 基因序列的获得及研究所需引物的设计  53
  3.2 SlDEAH1 基因的生物信息学分析结果  53-57
    3.2.1 核苷酸及编码蛋白序列的理化性质分析  53-54
    3.2.2 SlDEAH1 蛋白二级结构预测、保守结构域搜索以及蛋白序列同源比对  54-57
  3.3 番茄总 RNA、CDNA 鉴定及 SlDEAH1 基因全长的克隆结果  57-58
    3.3.1 所提取的番茄总 RNA 完整性、质量及其 cDNA 可用性鉴定  57-58
    3.3.2 SlDEAH1 基因全长的克隆结果  58
  3.4 SlDEAH1 基因的组织特异性表达模式分析  58-59
  3.5 SlDEAH1 基因的胁迫处理表达分析  59-60
  3.6 SlDEAH1 基因的激素处理表达分析  60-61
  3.7 SlDEAH1 基因的沉默表达载体构建  61-62
  3.8 SlDEAH1 基因的 RNAi 表达载体转化番茄子叶外植体  62-67
    3.8.1 SlDEAH1 的 RNAi 表达载体转入农杆菌 LBA4404  62
    3.8.2 SlDEAH1 基因的 RNAi 表达载体转化番茄子叶外植体  62-63
    3.8.3 SlDEAH1 基因的 RNAi 转基因番茄的鉴定  63-64
    3.8.4 SlDEAH1 基因的 RNAi 转基因番茄表型及统计学分析  64-67
4 讨论  67-71
  4.1 SlDEAH1 的生物信息学分析研究  67
  4.2 SlDEAH1 基因的组织特异性表达分析研究  67-68
  4.3 SlDEAH1 基因的激素及胁迫表达分析研究  68-69
  4.4 SlDEAH1 基因转基因番茄表型及统计学分析研究  69-71
5 结论与展望  71-73
  5.1 本研究的主要结论  71-72
  5.2 本研究后续工作展望  72-73
致谢  73-75
参考文献  75-83
附录  83
  A. 作者在攻读硕士学位期间的论文目录  83
  B. 作者在攻读硕士学位期间参加的科研项目  83
  C. 作者在攻读硕士期间所从事的其他科研工作  83
  D. 作者在攻读硕士期间所获奖项  83

番茄DEAD-box解旋酶基因SlDEAH1的克隆与功能研究

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