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紫花苜蓿抗铝候选基因研究

作　者: 宋文静
导　师: 王凭青
学　校: 重庆大学
专　业: 生物学
关键词: ABC转运子 紫花苜蓿 铝毒 MsSTAR1 MsSTAR2
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


酸性土壤中，Al3+和H+根毒性是影响作物生长的主要限制因子。植物已经演化出部分耐受铝毒和质子毒性的机制，而这些生理过程的分子机制仍然很少被描述。本研究克隆出水稻耐铝基因STAR1和STAR2在紫花苜蓿中的同源基因MsSTAR1和MsSTAR2。MsSTAR1编码一个ABC转运子核苷酸结合域，它是水稻OsSTAR1和拟南芥AtSTAR1的同源基因，OsSTAR1和AtSTAR1分别参与水稻和拟南芥的耐铝作用。基因的编码序列全长780bp，编码了259个氨基酸（GenBank登录号：KC430620）。MsSTAR1在所有的组织中都有表达，它主要分布在根基部（1cm-2cm）和叶中。与OsSTAR1和AtSTAR1不同，Al3+或者H+处理都能诱导MsSTAR1的表达，且随着处理浓度的增大，基因的表达量也越大。然而，基因却不响应其他金属离子。此外，我们发现，在紫花苜蓿中MsSTAR1基因的表达量和植物的耐性并没有正相关的关系。Al3+处理12h后，基因的表达量最大，表明基因不是立即诱导的。这些结果表明MsSTAR1是紫花苜蓿的铝激活基因，它可能诱导由铝损伤引起的保护机制，可能与一个跨膜蛋白相互作用形成一个细菌性ABC转运子。基因MsSTAR2编码一个ABC转运子跨膜域（GenBank登录号：KC430619），MsSTAR2基因的编码区序列全长864bp，编码了287个氨基酸，它与水稻耐铝基因OsSTAR2和拟南芥耐铝基因AtALS3有较高的同源性。MsSTAR2在根、茎和叶组织中都有表达，且在叶中的表达量最高。与OsSTAR2和AtALS3不同，MsSTAR2同时受Al3+和H+的诱导，且随着处理浓度的增大，基因的表达量也越大，但它不响应于其他金属离子，如Cd2+，Mn2+等。此外，我们发现基因的表达量和紫花苜蓿的耐铝性间没有正相关的关系。Al3+处理12h后，基因的表达量最大，表明基因不是立即诱导的。这些结果表明，MsSTAR2是一个铝激活基因，它可能诱导铝损伤诱发的保护机制，通过与核苷酸结合域蛋白相互作用为一个完整的ABC转运子参与苜蓿的抗铝作用中。

全文目录


摘要  3-4
Abstract  4-9
1 绪论  9-19
  1.1 植物铝毒症状和抗铝机制  9-12
    1.1.1 植物铝毒症状  9-10
    1.1.2 植物抗铝机制  10-12
    1.1.3 镁离子在缓解植物铝毒中的作用  12
  1.2 耐铝基因概述  12-18
    1.2.1 ALMT 家族和 MATE 家族蛋白有利于根部分泌有机酸阴离子  13-14
    1.2.2 ABC 转运子家族  14-15
    1.2.3 Nramp 家族  15
    1.2.4 与铝毒抗氧化防御机制相关的基因  15-16
    1.2.5 耐铝基因表达的调控  16-17
    1.2.6 总结  17-18
  1.3 研究目的、内容和意义  18-19
2 紫花苜蓿 MsSTAR1 基因的克隆和序列分析  19-30
  2.1 引言  19
  2.2 材料  19-21
    2.2.1 植物材料  19
    2.2.2 实验试剂  19-20
    2.2.3 仪器  20
    2.2.4 溶液试剂配制  20
    2.2.5 菌株和试剂盒  20-21
    2.2.6 分析工具软件与网站  21
  2.3 方法  21-26
    2.3.1 紫花苜蓿幼苗的培养  21
    2.3.2 紫花苜蓿 RNA 提取  21-22
    2.3.3 cDNA 的合成  22-23
    2.3.4 PCR 扩增目的片段  23-24
    2.3.5 目的片段产物的切胶回收  24
    2.3.6 回收产物的克隆测序  24-25
    2.3.7 生物信息学分析  25-26
  2.4 结果与分析  26-28
    2.4.1 紫花苜蓿 RNA 的提取  26
    2.4.2 MsSTAR1 基因的序列分析  26-27
    2.4.3 MsSTAR1 基因的结构  27-28
  2.5 讨论  28-30
3 紫花苜蓿 MsSTAR1 基因的表达模式分析  30-41
  3.1 引言  30-31
  3.2 材料  31
    3.2.1 植物材料  31
    3.2.2 实验试剂及仪器  31
  3.3 方法  31-33
    3.3.1 苜蓿相对根伸长测量  31
    3.3.2 苜蓿幼苗的处理  31-32
    3.3.3 紫花苜蓿 RNA 提取  32
    3.3.4 cDNA 的合成  32
    3.3.5 Real Time PCR  32-33
  3.4 结果与分析  33-39
    3.4.1 紫花苜蓿铝敏感性分析  33-35
    3.4.2 MsSTAR1 基因的组织表达分析  35-36
    3.4.3 MsSTAR1 基因对 H~+胁迫和 Al~(3+)胁迫的响应  36-38
    3.4.4 MsSTAR1 基因对不同金属离子的响应  38-39
  3.5 讨论  39-41
4 紫花苜蓿 MsSTAR2 基因的克隆和序列分析  41-46
  4.1 引言  41-42
  4.2 材料  42
  4.3 方法  42
    4.3.1 紫花苜蓿幼苗的培养  42
    4.3.2 紫花苜蓿 RNA 提取  42
    4.3.3 cDNA 的合成  42
    4.3.4 PCR 扩增目的片段  42
    4.3.5 目的片段产物的切胶回收  42
    4.3.6 回收产物的克隆测序  42
    4.3.7 生物信息学分析  42
  4.4 结果与分析  42-44
    4.4.1 MsSTAR2 基因的序列分析  42-43
    4.4.2 MsSTAR2 基因的结构  43-44
  4.5 讨论  44-46
5 紫花苜蓿 MsSTAR2 基因的表达模式分析  46-55
  5.1 引言  46
  5.2 材料  46-47
  5.3 方法  47
    5.3.1 紫花苜蓿 RNA 提取  47
    5.3.2 cDNA 的合成  47
    5.3.3 Real Time PCR  47
  5.4 结果与分析  47-52
    5.4.1 MsSTAR2 在不同组织中的定量分析  47-48
    5.4.2 MsSTAR2 对 H~+胁迫的响应  48
    5.4.3 MsSTAR2 对 Al~(3+)胁迫的响应  48-50
    5.4.4 MsSTAR2 对不同金属离子胁迫的响应  50-51
    5.4.5 Mg~(2+)缓解紫花苜蓿铝毒分析  51-52
  5.5 讨论  52-55
6 总结与展望  55-57
  6.1 总结  55-56
  6.2 后续研究工作展望  56-57
致谢  57-58
参考文献  58-65
附录 作者在攻读硕士学位期间发表的论文目录  65

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中图分类: > 生物科学 > 植物学 > 植物细胞遗传学 > 植物基因工程
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