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番茄SlAGO7的克隆、鉴定及其功能研究

作　者: 向娅
导　师: 李正国
学　校: 重庆大学
专　业: 生物学
关键词: 番茄 SlAGO7 ta-siRNA途径叶极性发育花
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

ARGONAUTE (AGO)蛋白是一类高度保守且庞大的基因家族，作为沉默复合体的核心成分，在所有已知小RNA介导的沉默调控途径中发挥着关键作用。反式作用小RNA (ta-siRNA)是植物体内特有的一种內源小RNA，以剪切降解的方式对其靶标基因的mRNA进行负调控，从而影响植物正常的生长发育。AGO7蛋白是TAS3ta-siRNA生物合成途径中必需的组分，同时TAS3ta-siRNA的剪切作用活性也完全依赖于它。因此，AGO7蛋白在植物体内发挥的生物学功能部分是通过ta-siRNA途径来实现的。大量研究结果证实，ta-siRNA途径对侧生器官的近轴-远轴面的形态建成具有很重要且保守的调控作用。但是至今没有关于番茄ta-siRNA途径中的一些重要基因的分离及其参与叶、花发育的报道。所以，开展番茄SlAGO7基因的功能研究对深入阐明ta-siRNA途径在番茄生长发育过程的调控机理具有重要意义。为了研究SlAGO7的生物学功能，本文以番茄为材料，开展了以下几个方面的研究：1、根据番茄基因组数据库中SlAGO7的EST序列信息，利用RACE和PCR技术从番茄花cDNA和叶基因组DNA中分别克隆SlAGO7的cDNA全长序列和基因组DNA序列，用生物信息学方法对基因序列特征进行分析。结果显示：SlAGO7的cNDA全长片段为3238bp，含有3003bp的完整开放阅读框，编码1000个氨基酸，包含3个外显子和2个内含子。SlAGO7编码的氨基酸序列含有两个高度保守的PAZ和PIWI结构域，具有典型的AGO类蛋白的结构特征；与已报道的其他物种的AGO7蛋白的序列具有较高的同源性；SlAGO7基因属于AGO蛋白家族中的ZIPPY/AGO7亚家族。2、采用定量PCR方法，对SlAGO7基因进行时空表达模式分析，结果表明：SlAGO7在营养组织叶中微弱表达，主要集中在根和茎中表达；而在生殖器官花中强烈表达，表达丰度从花蕾到盛开的花呈递增趋势，但在果实的不同发育时期中表达都非常微弱甚至不表达。为了进一步明确SlAGO7在花中不同部分的表达特征，以开花当天的萼片、花瓣、雄蕊、雌蕊为材料，进行PCR定量检测，结果发现SlAGO7在萼片中表达量最高，花瓣与雌蕊种表达适中，在雄蕊中微弱表达。这些结果为推测和研究SlAGO7在番茄中的潜在生物学功能提供了一定的线索和思路。3、为了深入研究SlAGO7基因的功能，分别构建了SlAGO7基因超表达载体和反义抑制表达载体并转化番茄，对SlAGO7超表达植株进行形态学特征分析，结果表明，SlAGO7基因超表达导致叶片近轴面极性发育的异常和花形态的改变；同时，SlAGO7超表达后改变了TAS3ta-siRNA前体及其靶标基因的转录水平，表明SlAGO7基因对番茄侧生器官极性形成的调控是通过ta-siRNA途径来实现的。4、SlAGO7超表达之后，HD-ZIP III类转录因子SlREV、SlHB15、SlHB8、SlPHV、SlPHB的表达下调，同时，参与调控花器官形成的MADS-box转录因子SlAP2、SlAGL1的mRNA水平也发生改变，表明SlAGO7通过ta-siRNA途径可能间接地参与调节HD-ZIP III类和MADS-box转录因子的表达，从而实现对叶以及花器官形成的调控。

全文目录

摘要  3-5
ABSTRACT  5-9
1 绪论  9-16
  1.1 国内外研究现状  9-13
    1.1.1 Argonaute 蛋白的简介  9
    1.1.2 Argonaute 蛋白的功能  9-10
    1.1.3 植物反式作用小 RNA (ta-siRNA) 的产生机制  10-11
    1.1.4 TAS3 ta-siRNA 途径调控植物生长和发育  11-12
    1.1.5 叶近轴-远轴极性的发育  12-13
    1.1.6 花器官的建成  13
  1.2 研究内容与技术路线  13-15
    1.2.1 研究内容  13-14
    1.2.2 技术路线  14-15
  1.3 研究的目的和意义  15-16
2 番茄 SlAGO7 的克隆及表达分析  16-28
  2.1 材料与方法  16-19
    2.1.1 植物材料和质粒  16
    2.1.2 试剂和仪器设备  16
    2.1.3 SlAGO7 基因的分离及克隆  16-19
    2.1.4 序列分析  19
    2.1.5 实时定量 PCR 分析 SlAGO7 的表达模式  19
  2.2 结果与分析  19-26
    2.2.1 SlAGO7 基因的克隆  19-21
    2.2.2 SlAGO7 编码蛋白的序列分析  21
    2.2.3 氨基酸序列比对及其系统进化树构建  21-24
    2.2.4 SlAGO7 的表达模式分析  24-26
  2.3 讨论  26-27
  2.4 本章小结  27-28
3 番茄 SlAGO7 基因的遗传转化及功能分析  28-50
  3.1 材料与方法  28-35
    3.1.1 植物材料  28
    3.1.2 菌株和质粒  28
    3.1.3 试剂和设备  28
    3.1.4 主要溶液的配制  28-30
    3.1.5 方法  30-35
  3.2 结果与分析  35-47
    3.2.1 SlAGO7 基因正、反义植物表达载体的构建  35-37
    3.2.2 转基因番茄的获得及鉴定  37-39
    3.2.3 转基因植株的表型分析  39-41
    3.2.4 SlAGO7 超表达对花形态和花序的影响  41-43
    3.2.5 SlAGO7 超表达引起 TAS3 ta-siRNA 靶标基因的表达变化  43-45
    3.2.6 SlAGO7 影响到与叶和花形成相关的基因表达  45-47
  3.3 讨论  47-48
  3.4 本章小结  48-50
4 结论与展望  50-52
  4.1 结论  50
  4.2 本研究的创新点  50
  4.3 后续研究工作展望  50-52
致谢  52-53
参考文献  53-58
附录  58
  A. 作者在攻读硕士学位期间发表的论文  58
  B. 作者在攻读硕士学位期间参加的科研项目  58

番茄SlAGO7的克隆、鉴定及其功能研究

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