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拟南芥acs7-1突变体的研究和小立碗藓ACS-like基因的功能分析

作　者: 董慧
导　师: 王宁宁
学　校: 南开大学
专　业: 植物学
关键词: 拟南芥乙烯 acs突变体小立碗藓 PpACL(PpACS-like) CS裂解酶
分类号: Q943
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

乙烯是一种非常重要的植物激素,参与调控植物生长发育的多个过程以及对多种生物和非生物胁迫的响应。对乙烯合成的调控及其进化机制的研究已成为近年来科学家关注的热点。维管植物中,乙烯生物合成的限速酶是1-氨基环丙烷-1-羧酸(1-Amino-cyclopropane-1-carboxylate, ACC)合成酶(ACC synthase, ACS),它催化乙烯前体物质ACC的合成,由多基因家族编码。模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)的ACS基因家族中有9个成员,但每个成员在植物生长发育和逆境应答中的具体功能及其作用机制还不太清楚。苔藓植物是最早登陆的绿色植物,它们没有维管组织,代表着陆生植物进化中不同于维管植物的一个谱系。虽然序列分析结果显示模式植物小立碗藓(Physcomitrella patens, P. patens)的基因组中有2个ACS-like (PpACL)基因,但P. patens中是否有乙烯合成、乙烯合成的前体是否是ACC、以及是否存在类似于维管植物的乙烯合成路径还不清楚。本文的研究内容分为两部分。第一部分主要是对拟南芥ACS家族多个成员的T-DNA插入突变体,尤其是acs7-1突变体的研究。实验室前期研究发现,ACS2、4、8和9基因突变不同程度地降低了拟南芥对一些非生物胁迫的耐受性；而ACS7基因的突变反而导致拟南芥抵御高温和盐等非生物胁迫的能力加强。在此基础上,我们继续探讨了ACS7基因在拟南芥生长发育和逆境响应中的作用机制。我们发现ACS7基因的缺失抑制了ACS2、4、‘5和6基因的表达,造成acs7-1突变体中的乙烯水平显著下降(仅为野生型的约1/3)。相应地,突变体中乙烯响应基因ERF1、ERF2和AtEBP的表达量降低。在高温胁迫下,由热激转录因子(heat shock transcription factors, HSFs)诱导合成的热激蛋白(heat shock proteins, HSPs)可防止蛋白质不可逆变性,协助损伤蛋白重薪折叠,恢复原有的空间构象。实时定量RT-PCR的结果显示,acs7-1突变体中多个高温诱导的Hsf和Hsp基因在胁迫早期的表达水平显著高于野生型对照；多个ABA相关的胁迫诱导基因在盐胁迫下的表达程度比野生型对照大幅度提高,且盐诱导的ABA的积累量也显著高于野生型,说明ABA合成的提高和响应的增强在acs7-1幼苗的抗盐机制中发挥着重要的作用。当外源添加ABA合成抑制剂或ABA类似物时,突变体和野生型中由于ABA引起的差异被消除,acs7-1对盐的耐受性甚至变得比野生型对照更低。这与乙烯正向调控拟南芥的抗盐机制是一致的。这些实验结果说明ACS7基因在逆境胁迫下的ABA合成和响应过程中发挥负调节因子的作用,是乙烯和ABA之间cross-talk的一个“节点”。此外,ACS7还在拟南芥的种子萌发、叶片和主根发育等过程中发挥重要作用。对其他ACS缺失突变体包括acs2-2、acs4-3、acs8-3和acs9-1的研究发现,ACS8正向调控外源IAA对侧根发生的诱导作用,而ACS4和ACS8负向调控ABA对种子萌发的抑制作用。此外,我们还分离鉴定了一个乙烯过量突变体acs5-3。序列分析发现,T-DNA片段的插入破坏了突变体中全长ACS5基因的表达,但过表达了一个5’端截短的ACS5序列,导致突变体中的乙烯合成增加、信号响应增强。该突变体还表现出一些乙烯过量相关的表型,例如：相对于野生型,acs5-3突变体黄化苗的根较短；光照幼苗的根毛较多、主根较短,而侧根发生无明显差异；成苗表现出早抽苔、早花、早衰以及叶片偏上性生长等表型。acs5-3幼苗对IAA诱导的侧根发生超敏,并且AVG可抑制此超敏表型。这些结果说明突变体中ACS5蛋白N端的缺失并不影响其催化功能。本文第二部分是对PpACLs基因功能的研究。根据Phytozome数据库提供的基因信息,我们从P.patens中克隆了PpACL1和PpACL2的全长cDNA.我们首先分别构建了在PpACL1N端或C端融合His标签的原核表达载体,并转入大肠杆菌(E. Coli)BL21RosettaTM2(DE3)plysS中,以空载体为负对照、融合His标签的AtACS7重组蛋白为正对照,体外检测PpACL1重组蛋白的ACS活性。结果显示,诱导表达PpACL1时,析入到菌体培养液中的ACC含量没有增加；纯化的PpACL1重组蛋白也没有催化ACC合成的功能。同时,过表达PpACL1的35S::PpACL1转基因拟南芥中乙烯合成没有增加,也不表现乙烯过量的典型表型。这些结果表明PpACL1的编码产物没有ACC合成酶的功能。ACC合成酶、氨基转移酶以及CS裂解酶同属依赖于PLP的AAT-like蛋白家族。由于它们的蛋白序列相似性很高,历史上曾有功能混淆的情况发生。因此,我们采用体外酶活测定的方法进一步分析了PpACL1是否具有氨基转移酶和CS裂解酶的活性。结果显示,PpACL1也不具备氨基转移酶的功能,但是具有CS裂解酶的催化活性,可催化L-胱氨酸和L-半胱氨酸碳硫键的断裂,但不能催化L-胱硫醚和S-甲基-L-半胱氨酸碳硫键的断裂。另一方面,我们也对PpACL2的功能进行了初步分析。在大肠杆菌中诱导表达PpACL2重组蛋白不会导致菌体培养液中ACC含量的增加,暗示PpACL2也不具有ACC合成酶的功能。而PpACL2的生化性质还需要进一步分析。上述研究结果表明小立碗藓基因组中的两个ACS-like基因均不编码ACC合成酶,暗示着如果小立碗藓中有乙烯合成的话,其合成路径可能不同于维管植物中的Yang Cycle。

全文目录

摘要  5-8
Abstract  8-11
目录  11-15
第一篇拟南芥acs7突变体的研究  15-65
  第一章前言  16-33
    第一节乙烯合成以及信号通路  16-20
      1.1 乙烯概述  16-17
      1.2 乙烯生物合成  17-18
      1.3 乙烯信号  18-20
    第二节乙烯与其他激素的相互作用  20-23
      2.1 对植物生长发育的调控  20-21
      2.2 对植物非生物胁迫应答的调控  21-23
    第三节乙烯生物合成的限速酶ACS  23-30
      3.1 高等植物ACS的序列特点  23-24
      3.2 拟南芥中的ACS及其调控  24-28
      3.3 拟南芥acs突变体的研究进展  28-30
    第四节课题的提出及其意义  30-33
  第二章材料与方法  33-40
    第一节实验材料  33-34
      1.1 植物材料  33
      1.2 植物激素和抑制剂  33-34
    第二节实验方法  34-40
      2.1 T-DNA插入突变体的鉴定  34-35
      2.2 突变体的表型观察  35-36
      2.3 实时定量RT-PCR  36-38
      2.4 乙烯释放量和ABA含量的测定  38-39
      2.5 叶绿素、脯氨酸和可溶性糖含量测定以及GUS组织化学染色  39-40
  第三章实验结果  40-61
    第一节 acs7-1突变体的研究  40-51
      1.1 acs7-1的乙烯释放量,乙烯响应基因和其它ACS基因的表达变化  40-41
      1.2 acs7-1在正常发育条件下的表型  41
      1.3 acs7-1对非生物胁迫的响应(高温、盐)  41-46
      1.4 ABA在acs7-1抗盐机制中的作用  46-49
      1.5 acs7-1对SA的响应  49-51
    第二节乙烯过量突变体acs5-3的研究  51-58
      2.1 acs5-3中T-DNA的插入位点和方向  51-52
      2.2 acs5-3突变体的鉴定  52-53
      2.3 acs5-3的乙烯释放量以及EBS：：GUS的表达  53-54
      2.4 acs5-3正常生长发育条件下的表型  54-57
      2.5 acs5-3对IAA的响应  57-58
    第三节 5个acs缺失突变体对IAA和ABA的响应  58-61
      3.1 acs突变体幼苗对IAA的响应  58-59
      3.2 acs突变体种子对ABA的响应  59-61
  第四章讨论  61-65
    第一节 ACS7在逆境响应中的独特性  61-62
    第二节 ACS5的N端对其功能的影响  62
    第三节 ACS基因缺失对IAA和ABA响应的影响  62-65
      3.1 ACS基因对IAA诱导侧根发生的影响  63
      3.2 ACS基因对ABA抑制种子萌发的影响  63-65
第二篇小立碗藓ACS-like基因的功能分析  65-100
  第一章前言  66-74
    第一节小立碗藓的进化地位以及预测的PpACS-like基因  66-70
      1.1 植物登陆中的重大事件  66-67
      1.2 小立碗藓(Physcomitrella patens,P.patens)概述及进化地位  67-68
      1.3 小立碗藓中的乙烯信号  68-70
    第二节 AAT-like蛋白家族  70-72
    第三节课题的提出及其意义  72-74
  第二章材料与方法  74-80
    第一节实验材料  74-75
      1.1 植物材料  74
      1.2 构建和菌株  74
      1.3 抗体  74-75
    第二节实验方法  75-80
      2.1 构建  75-76
      2.2 定位  76-77
      2.3 蛋白表达、纯化以及鉴定  77
      2.4 ACS活性测定  77-78
      2.5 拟南芥乙烯释放量测定  78
      2.6 氨基转移酶活性测定  78
      2.7 CS裂解酶活性测定  78-80
  第三章实验结果  80-97
    第一节 P.patens中的ACS-Like基因  80-84
      1.1 P.patens中ACS-Like基因的预测  80
      1.2 PpACL基因编码蛋白的生物信息学分析  80-84
    第二节 PpACL1的功能分析  84-95
      2.1 PpACL1蛋白的定位  84-85
      2.2 PpACL1和His融合蛋白的原核表达  85-86
      2.3 PpACL1的ACS功能验证  86-89
      2.4 PpACL1蛋白的AT(aminotransferase)功能验证  89-93
      2.5 PpACL1蛋白的CS裂解酶功能验证  93-95
    第三节 PpACL2功能的初步分析  95-97
  第四章讨论  97-100
    第一节 PpACL1和PpACL2基因不编码ACC合成酶  97-99
      1.1 PpACL1蛋白的活性分析  97-98
      1.2 PpACL2蛋白活性的初步分析  98-99
    第二节 ACS基因进化  99-100
创新与突破  100-101
参考文献  101-110
致谢  110-111
个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果  111

拟南芥acs7-1突变体的研究和小立碗藓ACS-like基因的功能分析

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