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TNF-α、IL-1β通过PKA/CREB信号通路诱导成纤维样滑膜细胞中力生长因子表达

作　者: 黄杨河
导　师: 杨力
学　校: 重庆大学
专　业: 生物学
关键词: 力生长因子 TNF-α IL-1β IL-6 PKA/CREB信号通路
分类号: Q25
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

力效应细胞是指能对力刺激产生响应的细胞，包括骨骼肌细胞、平滑肌细胞、心肌细胞、成纤维细胞、成骨细胞、内皮细胞等。力效应细胞在受到力刺激时表达IGF-1基因的剪接变异体IGF-1Ec，在人体中称为力生长因子（Mechano growthfactor，MGF）。该因子具有多种生物学功能。它能激活肌肉卫星细胞，抑制其分化，促进肌肉肥大，修复肌损伤；也能保持心肌梗塞后心肌的收缩功能，起到心脏保护作用，同时还能有效促进运动神经元撕裂和挤压损伤的恢复。MGF的这些生物学功能在组织修复领域具有广阔的应用前景。组织、器官损伤后，通常伴随着炎症响应。炎性因子TNF-α、IL-1β提高成纤维样细胞中第二信使cAMP的表达水平，而第二信使对MGF的表达有促进作用。因而，炎症响应与MGF的表达调控是否存在联系是值得我们探讨的问题。本课题主要研究工作和结果如下：①使用组织块培养法提取人成纤维样滑膜细胞，并对原代提取的细胞进行H&E染色和成纤维样细胞标记Vimentin的免疫组化鉴定。建立后续实验所需的细胞库。②运用定量PCR方法检测正常成纤维样滑膜细胞（FLSs）和类风湿性关节炎滑膜细胞（RA-FLSs）中MGF的表达水平，结果发现RA-FLSs细胞中MGF的平均水平较FLSs中高，但两组表达量没有统计差异。③分别用炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6刺激FLSs，检测MGF mRNA的表达量。实验发现TNF-α、IL-1β能显著诱导MGF表达的提高。IL-6对MGF表达无影响。④以PKA信号通路特异性抑制剂KT5720预处理FLSs，随后用TNF-α、IL-1β刺激细胞，收集细胞总RAN和总蛋白，检测MGF mRNA表达量，以及PKA信号通路下游转录因子CREB及其Ser133位磷酸化p-CREB蛋白的表达差异。研究发现，TNF-α、IL-1β诱导的MGF表达是通过PKA/CREB信号通路实现的。综上所述，我们认为TNF-α、IL-1β通过PKA/CREB信号通路诱导人FLSs细胞中MGF的表达。

全文目录

摘要  3-4
ABSTRACT  4-9
缩略词  9-11
1 绪论  11-17
  1.1 问题的提出  11-12
  1.2 国内外研究现状  12-15
    1.2.1 IGF-Ⅰ基因的选择剪接  12-13
    1.2.2 MGF 在不同组织中的表达  13-14
    1.2.3 MGF 的生物学功能  14-15
    1.2.4 MGF 表达调控机制  15
  1.3 研究目的及内容  15
  1.4 创新点  15-17
2 人成纤维样滑膜细胞的体外培养及鉴定  17-25
  2.1 引言  17-18
  2.2 实验材料  18-19
    2.2.1 实验细胞  18
    2.2.2 主要仪器设备及耗材  18
    2.2.3 主要试剂  18-19
    2.2.4 主要试剂的配置方法  19
  2.3 实验方法  19-21
    2.3.1 成纤维样滑膜细胞的体外分离和原代培养  19-20
    2.3.2 成纤维样滑膜细胞 H&E 染色  20-21
    2.3.3 成纤维样滑膜细胞 Vimentin 染色  21
  2.4 实验结果  21-23
    2.4.1 成纤维样滑膜细胞的体外分离和原代培养  21-22
    2.4.2 成纤维样滑膜细胞的 H&E 染色  22-23
    2.4.3 成纤维样滑膜细胞的 Vimentin 染色  23
  2.5 讨论  23
  2.6 本章小结  23-25
3 FLSs 和 RA-FLSs 中 MGF 表达的差异  25-32
  3.1 引言  25
  3.2 实验材料  25-26
    3.2.1 实验细胞  25
    3.2.2 主要仪器设备及耗材  25-26
    3.2.3 主要试剂  26
    3.2.4 主要试剂的配置方法  26
  3.3 实验方法  26-30
    3.3.1 正常 FLSs 和 RA-FLSs 的传代培养  26
    3.3.2 细胞总 RNA 提取，定量和反转录  26-28
    3.3.3 Real-time PCR 法检测正常 FLSs 和 RA-FLSs 细胞中 MGF 表达  28-29
    3.3.4 MGF 表达量的相对定量分析  29-30
  3.4 实验结果  30
    3.4.1 FLSs 和 RA-FLSs 中 MGF 表达情况  30
  3.5 讨论  30
  3.6 本章小结  30-32
4 炎症因子 TNF-α，IL-1β，IL-6 对 MGF 表达的影响  32-40
  4.1 引言  32
  4.2 实验材料  32-33
    4.2.1 实验细胞  32
    4.2.2 主要仪器设备及耗材  32-33
    4.2.3 主要试剂  33
    4.2.4 主要试剂的配置方法  33
  4.3 实验方法  33-37
    4.3.1 因子处理  33
    4.3.2 细胞总 RNA 提取，定量和反转录  33-35
    4.3.3 Real-time PCR 法检测细胞中 MGF 表达  35-36
    4.3.4 MGF 表达量的相对定量分析  36-37
  4.4 实验结果  37-38
    4.4.1 TNF-α诱导 FLSs 中 MGF 表达  37
    4.4.2 IL-1β诱导 FLSs 中 MGF 表达  37-38
    4.4.3 IL-6 对 FLSs 中 MGF 表达无影响  38
  4.5 讨论  38-39
  4.6 本章小结  39-40
5 抑制剂 KT5720 对 TNF-α，IL-1β诱导的 MGF 表达的影响  40-46
  5.1 引言  40
  5.2 实验材料  40-41
    5.2.1 实验细胞  40
    5.2.2 主要仪器设备及耗材  40
    5.2.3 主要试剂  40-41
    5.2.4 主要试剂的配置方法  41
  5.3 实验方法  41-44
    5.3.1 因子处理  41
    5.3.2 细胞总 RNA 提取，定量和反转录  41-43
    5.3.3 Real-time PCR 法检测细胞中 MGF 表达  43-44
    5.3.4 MGF 表达量的相对定量分析  44
  5.4 实验结果  44-45
    5.4.1 PKA 信号通路介导 TNF-α，IL-1β诱导的 MGF 表达  44-45
  5.5 讨论  45
  5.6 本章小结  45-46
6 TNF-α，IL-1β对 PKA 信号通路下游转录因子 CREB 的影响  46-53
  6.1 引言  46
  6.2 实验材料  46-48
    6.2.1 实验细胞  46
    6.2.2 主要仪器设备及耗材  46-47
    6.2.3 主要试剂  47
    6.2.4 主要试剂的配置方法  47-48
  6.3 实验方法  48-51
    6.3.1 因子处理  48
    6.3.2 Western blot 检测 CREB、p-CREB 蛋白表达  48-51
  6.4 实验结果  51
    6.4.1 TNF-α、IL-1β对 CREB、p-CREB 蛋白的影响  51
  6.5 讨论  51-52
  6.6 本章小结  52-53
7 结论与展望  53-54
  7.1 主要结论  53
  7.2 本文存在的不足与后续工作展望  53-54
致谢  54-55
参考文献  55-61
附录  61
  作者在攻读学位期间发表的论文目录  61

TNF-α、IL-1β通过PKA/CREB信号通路诱导成纤维样滑膜细胞中力生长因子表达

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