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支气管哮喘(简称哮喘)是一种严重影响人类健康的慢性呼吸道疾病。研究显示,全球哮喘病人约3亿,我国哮喘患者数量庞大,且有不断增加的趋势。哮喘这一基因与环境因素共同导致的复杂疾病,即使在今天生物-环境-心理的疾病评估模式中,其发病、发展等环节仍不清楚,故此,目前对哮喘患者的治疗以症状控制为主。多项临床研究都表明,尽管大部分诊断明确的患者在规范化治疗后症状能够得到有效控制,却无法逆转或阻止哮喘的自然病史,最终产生不可逆的气道结构性改变。可以看到,哮喘的发病机制不明,使得哮喘的预防和根治成为了不可能的任务。因此探讨哮喘发病机制、寻找新的治疗乃至预防靶点仍然是呼吸专业关注的重大课题。随着研究的不断拓展和深入,关于哮喘发病的假说不断增多,其中气道局部环境结构、功能受损,免疫作用异常成为研究热点,气道在哮喘发病中的地位被大大提升。支气管上皮细胞(HBE),作为气道抵抗外来侵害的第一道防线,其物理屏障作用非常明显,气道上皮通透性增高是致喘物质接触上皮下免疫细胞的第一环。同时HBE在气道固有免疫中也发挥着重要的作用。近年来也证实,HBE是哮喘固有免疫与获得性免疫联系的桥梁,在多种触发因素作用下,HBE释放多种炎性介质如近年来证实与哮喘炎症相关的TSLP, VEGF,与免疫、炎性细胞发生广泛的联系,还能够通过上皮间充质转化成为气道结构细胞参与气道重建过程,可见HBE从各个环节参与了哮喘的发生、发展。哮喘中多种细胞因子表达、释放存在异常,这些因子参与了气道免疫失衡的发生、发展,维持着哮喘气道炎症,促使气道改建。因此,探讨引发炎症失衡的关键细胞因子会给哮喘的防治带来新的曙光。有研究通过转基因动物实验表明,阻断血管内皮生长因子(VEGF),能使哮喘的气道炎症、气道重塑、气道高反应性等病理生理变化趋于正常化。本课题组前期研究已经证实VEGF在职业哮喘诱发因素甲苯二异氰酸盐(TDI),屋尘螨以及过氧化氢等能够导致HBE通透性增高的过程中发挥重要作用。上述均提示VEGF在哮喘的发病中占有一席之地,VEGF可能成为哮喘防治的重要靶点。1,25-二羟维生素D3(1,25(OH)2D3)是维生素D3的生物活性代谢产物,现在学界将其归为激素一种,而不仅仅是维生素。它的生物学效应是由一种核受体超家族成员-维生素D受体(Vitamin D receptor, VDR)介导,同时还有一部分效应是通过与胞膜的VDR结合,经由非基因组信号转导实现的。1,25-二羟维生素D3除了调节钙和骨代谢,还发挥重要的免疫调节作用。APC和T细胞是它在免疫系统中发挥作用的主要靶细胞。1,25-二羟维生素D3及其类似物可直接作用于T细胞,或通过调节APC的功能间接影响T细胞的功能。1,25-二羟维生素D3及其类似物如：25羟基维生素D3,都对APC和T细胞的作用,这种作用有赖于这两种细胞内VDR的表达,以及它们信号转导通路中的共同靶分子。已有许多实验证实,1,25-二羟维生素D。下调T细胞和APC内核因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)的表达。众所周知,哮喘的发生与免疫失调密切相关,维生素D对APC和T细胞的作用,是否是它在哮喘中进行调节的途径,尚不得而知,但已经有实验发现维生素D能够通过影响免疫细胞的活化、功能达到影响免疫相关疾病如：糖尿病,炎症性肠病的作用,那么它对同样由T细胞参与介导的哮喘又有怎样的作用,是个引人深思的课题。近期通过人类基因芯片的研究比对,研究者们发现：编码维生素D通路,包括维生素D的转活、代谢、作用途径的关键蛋白(CYP27A1,CYP27B1,CYP2R1,CYP24A1)以及一些可由维生素D调控转录的因子,它们的编码基因经统计分析与哮喘相关(P<0.05),这显示了维生素D与哮喘发病根本、直接的联系。近年来,环境因素和人们的生活模式在哮喘发病中的作用越来越明确。而一些人群健康问题,例如：普遍的人群维生素D低水平状况是否与一些疾病发生相关被研究者们关注。关于维生素D与过敏性疾病的研究层出不穷。在VDR敲除小鼠中诱发哮喘模型中发现,虽然IgE浓度增高和Th2型细胞因子增加,但这种小鼠并没有发生气道炎症、嗜酸粒细胞浸润或气道高反应性等哮喘样症状。上述研究证据说明了维生素D在哮喘发病中的地位。但维生素D调节哮喘的具体环节尚鲜见报道,本研究是在前期证明TDI促进气道上皮通透性部分经由VEGF途径的基础上,通过建立维生素D作用细胞的模型,试图观察这一过程,了解维生素D对正常16HBE和TDI刺激的16HBE的通透性及VEGF表达的影响,在体外探讨维生素D对气道上皮炎症介质的释放及屏障功能的影响及可能机制。方法：1、制备甲苯二异氰酸酯-人血清白蛋白复合物(TDI-HSA)。2、购买分析纯的25羟维生素D3。3、人支气管上皮细胞系16HBE的传代,培养。4、四唑盐(MTT)比色法检测(不同浓度)25羟维生素D3,TDI-HSA对16-HBE活力的影响。分组情况：(1)25羟维生素D3作用：对照组,2×10-9mol/L 25羟维生素D3组,4×10-9mol/L 25羟维生素D3组,6×10-9mol/L 25羟维生素D3组,8×10-9mol/L 25羟维生素D3组,10×10-9mol/L 25羟维生素D3组,12×10-9mol/L25羟维生素D3组,15×10-9mol/L 25羟维生素D3组,20×10-9mol/L25羟维生素D3组；(2)TDI-HSA刺激：对照组,20μg/mlTDI-HSA组,40μg/ml TDI-HSA组,60μg/ml TDI-HSA组,80μg/ml TDI-HSA组,100μg/ml TDI-HSA组,150μg/ml TDI-HSA组。5、测定不同浓度25羟维生素D3和TDI-HSA对16-HBE细胞单层电阻的影响。分组情况：(1)25羟维生素D3处理：阴性对照组,5×10-9mol/L 25羟维生素D3组,8×10-9mol/L 25羟维生素D3组,10×10"9mol/L 25羟维生素D3组；(2)TDI-HSA刺激：对照组,40μg/mlTDI-HSA组,80μg/ml TDI-HSA组,100μg/ml TDI-HSA组。上述作用因素作用细胞24h后,以膜电阻测定仪测量TRANSWELL小室的细胞单层,取平均值,计算标准化跨膜电阻。6、分别观察不同浓度25羟维生素D3和TDI-HSA对16-HBE VEGF基因表达的影响,分组情况：(1)25羟维生素D3：阴性对照组,5×10-9nol/L 25羟维生素D3组,8×10-9mol/L25羟维生素D3组,10×10-9mol/L 25羟维生素D3组;(2)TDI-HSA刺激：对照组,40μg/mlTDI-HSA组,80μg/ml TDI-HSA组,100μg/ml TDI-HSA组。按上述刺激24h后,收集细胞,试剂盒一步法提取总RNA,应用Real time-PCR检测16-HBE的VEGF基因表达情况。7、选取对VEGF抑制最明显的25羟维生素D3浓度5×10-9mol/L预先处理细胞,分别作用3h、6h、9h、12h、24h,吸出含有25羟维生素D3的培养基,换新鲜培养基,然后以终浓度为100μg/ml TDI-HSA刺激各组25羟维生素D3预处理细胞,24h后收集细胞,提取总RNA,应用Real time-PCR检测16-HBE的VEGF基因表达情况。依照步骤5,同样测定上述各组的跨细胞电阻,求得标准化电阻值。8、应用酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测上述细胞培养上清中VEGF蛋白表达情况。9、统计学方法：采用SPSS13.0统计软件分析,计量资料用均数±标准差表示,方差齐时,总体均数的比较采用单向方差分析(one-way ANOVA),各组间多重比较采用LSD法,方差不齐时总体均数的比较采用Welkch法,各组间多重比较采用Dunnett’s T3法检验,以P<0.05具有统计学意义。结果：1、不同浓度25羟维生素D3对16-HBE细胞活力影响：25羟维生素D3在12×10-9mol/L浓度以下时对细胞活力无显著影响(与对照组相比,P=0.321)。2、不同浓度的TDI-HSA对16-HBE细胞活力影响：当TDI-HSA浓度达到150μg/ml后,与对照组相比细胞活力显著下降,具有统计学差异(P<0.001)。3、TDI-HSA刺激可导致单层16HBE跨膜电阻减低(n=3,P=0.007),即增高单层16HBE通透性,同时可使VEGF表达显著升高(基因水平与对照组比较,P<0.001；蛋白水平与对照组比较,P=0.002,n=5)。4、10-8M的25羟基维生素D3直接作用于细胞,会减低跨膜电阻(与对照组比较,P=0.002),即增高细胞层通透性,同时可从mRNA水平(与对照组比较,P<0.001)和蛋白水平(与对照组比较,P<0.001)降低气道上皮细胞16HBE的VEGF表达量,5、25羟基维生素D3处理16HBE 12小时,可以显著降低TDI-HSA刺激引起的VEGF升高(与TDI-HSA刺激组比较,P<0.001)。6、25羟基维生素D3预处理细胞12h,再给以TDI-HSA刺激,TEER低于TDI直接刺激组(P=0.046),即25羟基维生素D3和TDI-HSA共刺激增高了气道上皮通透性。结论：1.25羟维生素D3可以降低16HBE VEGF的表达,对TDI诱导的16HBE VEGF的表达和释放同样具有抑制作用。2.25羟维生素D3能够增加16HBE单层通透性,也可协同促进TDI诱导的16HBE通透性的增加。3. VEGF是上皮通透性的重要调节因子,但气道上皮通透性除受VEGF调控外,还存在其他调节途径。
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