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MIP-T3在慢性阻塞性肺疾病患者呼吸道上皮的表达研究

作　者: 高志睿
导　师: 高兴林
学　校: 南方医科大学
专　业: 呼吸内科学
关键词: 肿瘤坏死因子受体相关因子3结合蛋白 慢性阻塞性肺疾病 纤毛 粘液纤毛清除功能
分类号: R563.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是一种具有气流受限特征的疾病,气流受限不完全可逆、呈进行性发展,与肺部对香烟烟雾等有害气体或有害颗粒的异常反应有关。COPD是一种全身性疾病,它严重影响着患者的生活质量,也给其家庭和社会带来了沉重的经济负担。但COPD发病机制还未完全明了。研究证实COPD患者存在气道上皮纤毛结构和功能的异常,纤毛的异常会导致粘液纤毛清除功能(mucociliary clearance, MCC)的下降,导致分泌物潴留,小气道阻塞,局部防御系统破坏,引起反复感染,是病情反复及逐渐加重的关键因素之一。纤毛结构和功能的异常在COPD的发生发展中起重要作用,目前对COPD纤毛结构和功能异常的机制特别其分子机制仍然不清楚,对该机制进行研究有利于COPD防治。肿瘤坏死因子受体相关因子3结合蛋白1 (Tumor necrosis factor receptor associated factor 3 (TRAF3)-interacting protein 1, TRAF3IP1 or MIP-T3)是一种纤毛蛋白,可能参与胞质中合成的纤毛蛋白运送到纤毛内组装的过程。MIP-T3也是一种微管结合蛋白,分子量83KD,是肿瘤坏死因子受体相关因子3(TRAF3)的结合蛋白,其与TRAF3同时表达时才能结合到微管上。另外还发现MIP-T3与IL-13受体α1亚单位结合,抑制IL-4/IL-13下游的信号转导STAT6的磷酸化。在模式生物如衣藻、秀丽隐杆线虫、斑马鱼、果蝇、小鼠中发现它同纤毛的形成和功能密切相关,在MIP-T3突变、缺陷和敲除模型中发现纤毛出现不同程度的改变,如纤毛稀疏、短小、微管结构缺陷或紊乱。人体观察发现MIP-T3在人体很多组织中,比如在支气管、肺、睾丸、卵巢、脊髓、甲状腺、前列腺等存在纤毛的组织都有表达,特别是在纤毛结构丰富的睾丸组织中表达量较高。由于MIP-T3在进化上存在高度的保守性,鉴于其在模式生物纤毛形成过程中的重要作用,我们推测其在人的纤毛形成过程中也起到重要作用。目前对其研究多集中在模式生物及细胞株,但尚未发现其与人类疾病尤其是呼吸道纤毛疾病的关系。Foxj1、Rfx3是纤毛形成的标志基因,在纤毛的形成过程中是关键调控作用的核因子,我们对照其观察MIP-T3的表达。本实验初步探讨MIP-T3在COPD纤毛异常中的作用及与临床指标和肺功能的关系,加深对COPD及纤毛功能的认识,同时对纤毛功能障碍在该疾病中造成的影响引起重视,为寻找COPD的其他治疗方法提供理论基础。目的通过比较COPD组、吸烟组和对照组间MIP-T3的表达和段以上支气管纤毛超微结构的差异,探讨MIP-T3在COPD纤毛异常所起的作用。方法研究对象分为3组,COPD组、吸烟组及对照组。入选病例均来源于2010年2月至2010年11月在广东省人民医院肺科或胸外科行肺叶切除术的患者。COPD组为吸烟指数≥10包/年,已确诊有COPD者,n=18,其中男17例,女1例,年龄49-75岁,平均62.2±9.4岁,其中腺癌14例,鳞癌3例,肺结核1例。诊断按照慢性阻塞性肺疾病诊治指南(2007年修订版)标准。吸烟组为吸烟指数≥10包/年,肺功能正常者,n=17,其中男16例,女1例,年龄41-74岁,平均57.4±10.4岁,其中腺癌15例,鳞癌1例,肺结核1例。对照组为无吸烟史,肺功能正常者,n=21,其中男18例,女3例,年龄41-76岁,平均58.6±11.2岁,腺癌18例,肺结核2例,鳞癌1例。各组的性别、年龄及疾病构成比无统计学差异,COPD组和吸烟组的吸烟量无显著性差异,资料具有可比性。收集远离肺肿物5cm以上的段以上支气管和末端肺组织,将支气管和末端肺组织分离后迅速投入液氮,另取一份支气管组织投入电镜固定液行预固定。制备透射电镜标本,观察纤毛的超微结构,计算纤毛轴丝超微结构异常(Axonemal ultrastructure abnormality, AUA),其包括纤毛膜水疱、中央微管移位或数量变化、外周微管移位及数量变化、复合纤毛及巨大纤毛五种类型,并计算各分类的异常百分率。液氮研磨组织,利用Trizol法提取总RNA并测定RNA浓度,余实验按TAKARA公司提供的逆转录及定量PCR试剂盒说明书进行。采用实时荧光定量RT-PCR的方法测定COPD组、吸烟组和对照组的支气管组织和肺组织的MIP-T3、Foxj1、Rfx3 mRNA的表达,计算目的基因的相对表达量：2-△cT(△CT=CT目的基因-CT内参基因)。结果1.纤毛异常百分率的比较情况及与临床指标的相关性分析1.1纤毛轴丝超微结构异常COPD组、吸烟组和对照组的纤毛轴丝超微结构异常百分率分别为(12.74±3.17)%vs(4.61±1.90)%vs(4.24±1.07)%,P<0.001。COPD组分别高于其余2组,差异有统计学意义(均P<0.01),但对照组和吸烟组间无显著性差异(P>0.05)。1.2纤毛膜水疱COPD组、吸烟组和对照组的纤毛膜水疱百分率分别为(1.38±0.82)%vs(0.19±0.12)%vs(0.15±0.13)%,P=0.002。COPD组分别高于其余2组,差异有统计学意义(均P<0.01),但对照组和吸烟组间无显著性差异(P>0.05)。1.3中央微管缺陷COPD组、吸烟组和对照组的纤毛膜水疱百分率的差异无统计学意义(0.19±0.26)%vs(0.03±0.06)%vs(0.01±0.03)%,P>0.05。1.4巨大纤毛COPD组、吸烟组和对照组的纤毛膜水疱百分率的差异无统计学意义(1.22±1.40)%vs(0.26±0.37)%vs(0.16±0.26)%,P>0.05。1.5外周微管缺陷COPD组、吸烟组和对照组的外周微管缺陷百分率分别为(5.20±1.52)%vs(3.08±1.09)%vs(1.86±0.89)%,P<0.001。COPD组高于其余2组(均P<0.01),吸烟组高于对照组(P<0.01)。1.6复合纤毛COPD组、吸烟组和对照组的复合纤毛缺陷百分率分别为(4.75±2.12)%vs(1.04±1.01)%vs(2.05±0.9)%,P=0.001。COPD组高于吸烟组和对照组(分别为P<0.05和P<0.01),对照组高于吸烟组(P<0.05)。1.7相关分析COPD组中,纤毛轴丝超微结构与FEV1成负相关(r=-0.766,P<0.05),与FEV1%pred成负相关(r=-0.777,P<0.05),与FEV1/FVC成负相关(r=-0.684.P<0.05)。2.支气管组织中各组的MIP-T3、Foxj1、Rfx3 mRNA表达结果比较2.1 MIP-T3:COPD组、吸烟组和对照组的表达量差异有统计学意义[0.021(0.013～0.034)]vs[0.043(0.033～0.053)]vs[0.034(0.019～0.052)],P=0.001,COPD组的表达量较对照组和吸烟组低(分别为P<0.05,P<0.01)。2.2 Foxj1:COPD组、吸烟组和对照组之间无统计学差异[0.014(0.006-0.028)]vs[0.027(0.014-0.063)]vs [0.018(0.012-0.032)], P>0.05。2.3 Rfx3:COPD组、吸烟组和对照组之间无统计学差异[0.025(0.007～0.044)]vs[0.021(0.013～0.048)]vs[0.019(0.008～0.058)],P>0.05。2.4相关分析：COPD组中,MIP-T3与Foxj1、Rfx3的相关性无统计学意义(P>0.05)。总体相关：MIP-T3与Foxj1成正相关(r=0.520,P<0.01),MIP-T3与Rfx3的相关性无统计学意义(P>0.05)。3.肺组织中各组的MIP-T3、Foxj1、Rfx3 mRNA表达结果比较3.1 MIP-T3:COPD组、吸烟组和对照组的表达量差异无统计学意义[0.035(0.020～0.045)]vs[0.030(0.022～0.038)]vs[0.028(0.025～0.042)],P>0.05。3.2 Foxj1:COPD组、吸烟组和对照组之间无统计学差异[0.007(0.004～0.010)]vs[0.008(0.005～0.015)]vs[0.007(0.005～0.012)],P>0.05。3.3 Rfx3:COPD组、吸烟组和对照组之间无统计学差异[0.009(0.006～0.017)]vs[0.008(0.005～0.014)]vs[0.012(0.007～0.021)],P>0.05。3.4肺组织中MIP-T3与Foxj1、Rfx3的相关性无统计学意义。4. COPD病人MIP-T3的表达与纤毛异常百分率及临床资料的相关分析4.1 MIP-T3的表达量与纤毛异常的相关性纤毛轴丝超微结构异常与MIP-T3无显著相关性。但在异常纤毛的各种类型中：支气管MIP-T3的表达量与外周微管缺陷异常百分率存在负相关(r=-0.750,P<0.05),与其余异常类型不存在相关性。4.2 MIP-T3与临床资料的相关性MIP-T3与吸烟指数、FVC、FEV1、FEV1%Pred、FEV1/FVC的相关性均无统计学意义。结论1. COPD病人存在纤毛结构的异常,主要表现为纤毛膜水疱增多、外周微管缺陷增加及复合纤毛增多,且病情越重纤毛结构的异常越明显。2.未发展成为COPD的吸烟者同样存在纤毛结构的异常,但仅表现为外周微管缺陷增加。3. COPD病人纤毛结构的异常可能与MIP-T3表达下调有关,而与Foxj1及Rfx3的表达无直接关系。

全文目录


摘要  3-8
ABSTRACT  8-15
前言  15-25
第一章 病例选择,支气管和肺组织的收集  25-27
  1、材料与方法  25-27
第二章 纤毛异常百分率的观察和测定  27-38
  1、材料与方法  27-30
  2、结果  30-34
  3、讨论  34-38
第三章 COPD患者MIP-T3、Foxj1、Rfx3基因表达研究  38-55
  1、材料与方法  38-42
  2、结果  42-51
  3、讨论  51-55
全文结论  55-56
参考文献  56-62
缩略词表  62-64
研究成果  64-65
致谢  65-67
统计学证明  67

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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 呼吸系及胸部疾病 > 肺疾病 > 其他
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