学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

CD36跨膜多肽的合成及其跨膜区相互作用机理研究

作　者: 左利民
导　师: 罗施中
学　校: 北京化工大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: CD36 固相合成跨膜区相互作用荧光共振能量转移(FRET) TOXCAT GXXXG序列结构
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 23次
引　用: 1次
阅　读: 论文下载

内容摘要

糖蛋白CD36作为一种跨膜蛋白,属于多功能细胞膜受体,作为脂肪感受的味觉受体,对研究肥胖及与脂肪摄入过多相关的疾病具有重要意义。同时CD36作为氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)的高亲和力受体,通过识别和内吞Ox-LDL,可导致泡沫细胞的形成和动脉粥样硬化的发生。因此对CD36结构和功能的机理研究能够为进一步设计相关新型药物提供理论依据。在本论文中我们通过对比NCBI蛋白质数据库上各个物种的CD36蛋白,得到CD36 N端/C端分别存在有高度保守的跨膜区。由于CD36跨膜区的相互作用对于跨膜信号的转导具有重要的意义,蛋白跨膜区具有重要的生物学意义,本论文首先运用化学固相合成法合成CD36 N端/C端跨膜区多肽,圆二色谱显示多肽二级结构均呈现典型α-螺旋特征,通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和荧光共振能量转移(FRET)方法对CD36跨膜区相互作用方式进行研究。SDS-PAGE显示CD36蛋白N端跨膜区多肽呈现明显二聚现象,相对应的C端跨膜区多肽为单体存在形式。通过对N端跨膜区多肽进行吡啶酸供体和香豆素受体标记进行FRET实验发现,在SDS表面活性剂环境中N端跨膜区标记多肽之间存在荧光共振能量转移现象,从而证明N端跨膜区形成二聚自组装体。由于上述方法都是在细胞膜的模拟环境如表面活性剂中进行跨膜螺旋相互作用的研究,本论文进而运用TOXCAT方法,在真实的大肠杆菌细胞膜环境中验证跨膜螺旋之间相互作用,进一步证明了CD36的N端跨膜区的二聚组装性质。本论文还通过基因突变手段得到CD36跨膜区的不同突变序列片段,突变特定序列中任一Gly(G16或G20)为Ile或Ala时二聚体破坏,说明跨膜区中GXXXG序列结构决定了跨膜区之间的相互作用。由于蛋白质二聚作用对跨膜信号传导意义重大,通过上述研究使我们更深入了解确定CD36跨膜区蛋白和其相应受体之间的相互作用方式和作用原理,由此确定跨膜区在免疫系统跨膜信号传递中所起的关键作用,进一步从分子水平上阐释免疫信号传导的机制,为潜在的治疗肥胖及心脑血管疾病多肽药物的设计和研究开发提供思路。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-12
第一章绪论  12-28
  1.1 前言  12
  1.2 CD36概述  12-15
    1.2.1 CD36的结构  12-13
    1.2.2 CD36的功能  13-15
  1.3 CD36跨膜多肽的合成  15-19
    1.3.1 固相合成法简介  15-18
      1.3.1.1 Boc合成法  16-17
      1.3.1.2 Fmoc合成法  17-18
      1.3.1.3 两种方法的比较  18
    1.3.2 纯化鉴定方法  18-19
      1.3.2.1 反相高效液相色谱(RP-HPLC)  18
      1.3.2.2 辅助基质电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)  18-19
  1.4 跨膜区蛋白相互作用研究  19-25
    1.4.1 SDS-PAGE  21
    1.4.2 圆二色谱(CD)  21-23
      1.4.2.1 圆二色谱基本原理  21-22
      1.4.2.2 蛋白质的圆二色性  22-23
    1.4.3 荧光共振能量转移(FRET)  23-24
    1.4.4 TOXCAT  24-25
  1.5 研究意义和内容  25-28
    1.5.1 研究意义  25
    1.5.2 研究内容  25-28
第二章 CD36跨膜多肽的合成及纯化鉴定研究  28-44
  2.1 前言  28
  2.2 实验仪器及材料  28-30
    2.2.1 实验仪器  28-29
    2.2.2 实验材料  29-30
  2.3 实验方法  30-34
    2.3.1 Fmoc固相多肽合成  30-32
      2.3.1.1 树脂溶胀处理  30
      2.3.1.2 脱除Fmoc氨基保护  30-31
      2.3.1.3 肽键的形成  31-32
      2.3.1.4 缩合形成肽链  32
      2.3.1.5 脱除侧链保护及多肽-树脂切割  32
    2.3.2 多肽荧光标记  32-33
    2.3.3 多肽分离纯化鉴定  33-34
      2.3.3.1 RP-HPLC分析  33-34
      2.3.3.2 多肽质谱鉴定  34
      2.3.3.3 RP-HPLC分离制备  34
  2.4 结果讨论与分析  34-41
    2.4.1 CD36跨膜多肽合成序列  34-35
    2.4.2 树脂和保护氨基酸的选择  35-36
    2.4.3 缩合剂的选择  36
    2.4.4 切割条件确定  36
    2.4.5 多肽RP-HPLC分析结果  36-39
    2.4.6 多肽质谱鉴定  39-40
    2.4.7 RP-HPLC制备结果  40-41
  2.5 本章小结  41-44
第三章 CD36跨膜区多肽作用机理研究  44-58
  3.1 前言  44
  3.2 实验仪器及材料  44-45
    3.2.1 实验仪器  44-45
    3.2.2 实验材料  45
  3.3 实验方法  45-49
    3.3.1 圆二色谱(CD)  45-46
      3.3.1.1 样品制备  46
      3.3.1.2 圆二色谱条件  46
    3.3.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳  46-48
      3.3.2.1 凝胶的配制  46-47
      3.3.2.2 制备样品进行电泳  47-48
      3.3.2.3 凝胶染色脱色  48
    3.3.3 荧光共振能量转移(FRET)  48-49
      3.3.3.1 样品制备  48-49
      3.3.3.2 FRET条件  49
  3.4 结果讨论与分析  49-57
    3.4.1 多肽构象的CD研究  49-51
    3.4.2 SDS-PAGE分析  51-52
    3.4.3 FRET研究分析  52-57
      3.4.3.1 荧光基团选择  52-53
      3.4.3.2 样品浓度标定  53-54
      3.4.3.3 标记多肽的FRET  54-55
      3.4.3.4 FRET竞争性分析  55-56
      3.4.3.5 FRET计量学研究  56
      3.4.3.6 理论计算  56-57
  3.5 本章小结  57-58
第四章 CD36蛋白细胞内作用机理研究  58-76
  4.1 前言  58
  4.2 实验仪器与材料  58-59
    4.2.1 实验仪器  58-59
    4.2.2 实验材料  59
  4.3 实验方法  59-68
    4.3.1 TOXCAT分析  59-64
      4.3.1.1 引物设计  60
      4.3.1.2 PCR扩增  60-61
      4.3.1.3 酶切  61
      4.3.1.4 连接  61-62
      4.3.1.5 感受态细胞的制备  62-63
      4.3.1.6 转化  63
      4.3.1.7 CAT活性检测  63-64
    4.3.2 MalE互补分析  64-65
    4.3.3 Western blot  65-66
    4.3.4 CD36突变体TOXCAT分析  66-68
      4.3.4.1 CD36跨膜区突变序列  66-67
      4.3.4.2 突变体引物设计  67
      4.3.4.3 突变体CAT活性检测  67-68
    4.3.5 突变体合成多肽研究  68
      4.3.5.1 突变体多肽分析鉴定研究  68
  4.4 结果讨论与分析  68-75
    4.4.1 CD36跨膜区TOXCAT分析结果  68-69
    4.4.2 MalE互补分析结果  69-70
    4.4.3 Western blot分析  70
    4.4.4 CD36突变体TOXCAT分析结果  70-71
    4.4.5 突变体多肽研究结果  71-75
      4.4.5.1 CD36-G16I多肽序列  71-72
      4.4.5.2 CD36-G16I多肽分析鉴定  72-73
      4.4.5.3 CD36-G16I多肽相互作用分析  73-75
  4.5 本章小结  75-76
第五章结论  76-78
  5.1 结论  76-77
  5.2 进一步展望  77-78
参考文献  78-84
附录  84-86
研究成果及发表的学术论文  86-88
致谢  88-90
作者和导师简介  90-91
附录  91-92

CD36跨膜多肽的合成及其跨膜区相互作用机理研究

内容摘要

全文目录

相似论文