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氟西汀对NLRP3炎症小体激活的抑制作用及其机制研究

作　者: 谈俊
导　师: 胡刚
学　校: 南京医科大学
专　业: 药理学
关键词: 氟西汀 NLRP3炎症小体 IL-1β 外周炎症抑郁症
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

氟西汀（fluoxetine）是一种选择性五羟色胺（serotonin，5-HT）再摄取抑制剂（selective serotonin reuptake inhibitors，SSRIs），能选择性地抑制突触前膜对5-HT的再摄取，从而增加突触间隙5-HT水平，达到治疗抑郁症的目的。氟西汀因具有顺应性、安全性、有效性等优点，一直是抑郁症治疗的首选药物。新近研究发现，氟西汀还具有神经保护、抗肿瘤、抗炎等药理作用。对全身性炎症（如感染性休克）模型动物的研究发现，氟西汀能有效抑制小胶质细胞活化以及炎症因子分泌；氟西汀还可通过减少炎症相关细胞、抑制白介素-1β（interleukin-1beta，IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）的释放而发挥抗炎作用。但是，氟西汀调节中枢和外周炎症反应的分子机制目前尚未阐明。抑郁症是一种常见的精神类疾病，主要临床表现为情绪低落，兴趣减低，悲观，缺乏主动性，自责自罪，饮食、睡眠差，严重者可出现自杀念头和行为。世界卫生组织预测，到2020年抑郁症将成为继高血压之后第二大临床慢性疾病。目前关于抑郁症发病机制的研究假说包括单胺假说、受体假说、脑源性神经营养因子假说、神经内分泌假说以及免疫炎性假说等。1995年，Maes首次提出了抑郁症免疫反应假说：即抑郁症伴有免疫系统的激活和炎性反应。近年来研究表明炎症因子，尤其是IL-1β在抑郁症的病理过程中发挥非常重要的作用：临床研究发现抑郁症患者脑脊液和外周血中IL-1β、TNF-α等炎症因子的表达水平显症药物能显著降低血清中IL-1β水平；长期温和应激和足电击习得性无助致抑郁的模型动物中脑内和外周IL-1β升高，应激前脑内注射IL-1受体拮抗剂，能阻断动物的抑郁样行为的产生。因此，抑郁症和炎症相关性以及抗抑郁药物抗炎作用的研究成为近年来基础和临床研究的热点。IL-1β主要产生于外周单核巨噬细胞和中枢小胶质细胞，并依赖NLRP3炎症小体的激活。NLRP3炎症小体（inflammasome）是由NLRP3（也称NALP3或者cryopyrin）、胱冬肽酶（cysteiny aspartate-specific protease，caspase-1）前体和构架蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC）组装而成的多蛋白复合物，是天然免疫系统的重要组成部分。NLRP3属于胞浆内模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs），能识别病原相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）或者宿主来源的危险信号分子（damage-associated molecular patterns，DAMPs），招募和激活促炎症蛋白酶胱冬肽酶-1（caspase-1），活化的caspase-1切割pro-IL-1β和pro-IL-18，最终生成成熟的IL-1β和IL-18。近年来研究发现，NLRP3炎症小体活化与多种疾病诸如糖尿病和Alzheimer病的发生发展相关，然而其与抑郁症的发生以及抗抑郁药氟西汀的治疗作用是否相关目前尚未见报道。因此，本文应用C57BL/6J小鼠制备慢性温和应激（chronic mild stress，CMS）诱导的小鼠抑郁症模型，研究NLRP3炎症小体介导的炎症反应是否参与抑郁症发病过程及其对氟西汀治疗作用的影响；应用RAW264.7巨噬细胞株，研究、阐明抗抑郁症药物氟西汀对NLRP3炎症小体激活的调节作用及其机制，揭示氟西汀抗抑郁作用的新机制，也为抑郁症的治疗提供新思路。目的：研究氟西汀对NLRP3炎症小体激活的影响及其机制。方法：1.应用C57BL/6J小鼠，建立CMS小鼠抑郁症模型，给予氟西汀治疗，共分为三组：对照组、CMS抑郁模型组、CMS抑郁模型+氟西汀给药组；通过糖水偏爱实验、悬尾试验以及强迫游泳试验确证CMS抑郁模型是否成功。2.应用蛋白质免疫印迹法（Western blotting）检测上述三组小鼠海马NLRP3炎症小体各组分（NLRP3、caspase-1、IL-1β）的表达。3.分离并培养上述三组小鼠骨髓源性巨噬细胞（bone marrow-derived macrophages，BMDM），应用Western blotting方法检测NLRP3炎症小体各组分的表达（NLRP3、caspase-1）；应用酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）的方法检测分泌入细胞上清的IL-1β水平。4.应用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）和三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）/尿酸盐晶体（monosodium urate，MSU）处理小鼠源性小胶质细胞株BV2及小鼠源性巨噬细胞株RAW264.7，应用Western blotting检测caspase-1、NLRP3的表达量，ELISA法检测细胞上清液中IL-1β分泌量，观察氟西汀对NLRP3炎症小体激活的影响。5.应用ROS探针H2DCF-DA进行荧光定量实验，检测氟西汀对LPS+ATP诱导RAW264.7细胞中ROS生成的影响。6.应用Western blotting方法检测氟西汀对ERK1/2、p38及JNK的磷酸化影响以及对核因子p65的表达变化。7.应用免疫共沉淀方法观察氟西汀对TXNIP/PKR与NLRP3结合的影响。结果：1.氟西汀抑制CMS诱导的小鼠海马及外周NLRP3炎症小体的激活CMS诱导的小鼠抑郁症模型中，海马脑组织和外周骨髓源性巨噬细胞（bonemarrow-derived macrophages，BMDM）的NLRP3炎症小体显著激活；氟西汀能抑制CMS诱导的海马组织和BMDM中NLRP3炎症小体的激活。2.氟西汀抑制LPS+ATP/MSU对NLRP3炎症小体的激活作用氟西汀抑制LPS+ATP/MSU诱导的小胶质细胞株BV2细胞NLRP3的表达（P <0.05）、caspase-1的活化（P <0.01）以及IL-1β的分泌（P <0.05）；同时氟西汀也能抑制巨噬细胞株RAW264.7细胞NLRP3的表达（P <0.01）、caspase-1的活化（P <0.01）以及IL-1β的分泌（P <0.01），表明氟西汀能抑制LPS+ATP/MSU诱导的NLRP3炎症小体的激活。3.氟西汀通过减少ROS的生成及PKR、MAPK的磷酸化而抑制NLRP3炎症小体的激活ROS探针荧光定量分析结果显示，氟西汀减少LPS+ATP诱导的RAW264.7细胞ROS的生成（P <0.05）；氟西汀抑制LPS+ATP诱导的RAW264.7细胞p65核移位，抑制ERK1/2、p38、JNK（MAPK）和PKR的磷酸化（P <0.05）；并且，氟西汀抑制TXNIP和NLRP3、PKR和NLRP3的相互作用，从而抑制NLRP3炎症小体的激活。结论：1. NLRP3炎症小体介导的炎症反应与抑郁症相关。2.氟西汀通过抑制中枢和外周NLRP3炎症小体激活而发挥抗炎作用。本文工作的创新之处：1.揭示NLRP3炎症小体介导的炎症反应与抑郁症相关性，提示NLRP3炎症小体可能是抑郁症治疗的新靶点；2.阐明氟西汀抑制NLRP3炎症小体激活而发挥抗炎作用的新机制，揭示了抗抑郁药物的新的药理作用。

全文目录

英文缩略词表  6-8
中文摘要  8-12
ABSTRACT  12-15
前言  15-25
材料与方法  25-30
结果  30-42
讨论  42-46
结论  46-47
参考文献  47-56
综述  56-72
  参考文献  65-72
攻读硕士期间发表文章情况  72-73
致谢  73

氟西汀对NLRP3炎症小体激活的抑制作用及其机制研究

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