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热休克蛋白70在高压氧预防减压病中的作用机制

作　者: 倪啸晓
导　师: 徐伟刚
学　校: 第二军医大学
专　业: 航空、航天与航海医学
关键词: 减压病 高压氧 热休克蛋白 内皮细胞 一氧化氮
分类号: R82
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


当机体所处的环境气压发生快速大幅度变化时（如潜艇脱险、深水作业减压上浮、高空飞行或太空舱外活动），可引起溶解于组织的生理性惰性气体溢出形成气泡导致减压病（decompression sickness, DCS）的发生。气泡栓塞部位的不同可导致皮肤瘙痒、出血、关节疼痛甚至呼吸困难、瘫痪、死亡等不同表现。脊髓和肺是DCS气泡的主要靶器官。高压氧（hyperbaric oxygen, HBO）是治疗DCS的重要手段，目前已广泛应用于临床上一氧化碳中毒、神经损伤及糖尿病足等疾病的治疗。研究发现，HBO预处理可有效预防脊髓、脑、肝脏等多种组织的缺血缺氧性损伤。我们前期实验也发现，18h前单次HBO暴露可通过诱导一氧化氮（nitric oxide, NO）的生成降低大鼠DCS模型的发病率。然而，NO水平在HBO暴露结束后短时间内即恢复正常，何种机制介导了HBO暴露18h后的保护作用尚须深入研究。高压氧预适应可引起适度的氧化应激，通过动员热休克蛋白70（heat shock protein70，HSP70）等保护性蛋白的生成抵御各类损伤，HSP70除了可发挥分子伴侣功能和参与细胞耐热保护外，还可通过抗凋亡、抗氧化等功能对抗组织细胞损伤。因此，HSP70很可能作为HBO暴露诱导产生的保护性蛋白起到预防DCS的作用。本课题旨在研究HSP70在HBO预防DCS损伤中的作用，深入探索HBO预防DCS的机制，研究从在体、离体两方面展开，其中在体研究包括以下三方面：①研究HBO预适应对大鼠DCS模型气泡生成的影响。气泡生成是DCS发生的主要因素。在高气压暴露前18h分别给予大鼠HBO（280kPa-60min，n=10）或常压空气（n=10）预暴露，随后以“700kPa-90min空气暴露、3min减压”方案制备减压病模型。通过超声二维影像连续探测减压后2h内通过大鼠右心系统的气泡量，发现HBO并不影响DCS气泡生成量及生成速率，提示HBO预适应的保护作用并不是通过减少气泡生成量实现的。②观察HBO预适应对大鼠肺与脊髓HSP表达的影响。SD大鼠以280kPa-60min方案纯氧暴露后，分别在暴露后即刻、6、12、18、24、30h （n=6）取肺与脊髓，通过Western-blot及免疫组化检测HSP27、70和90蛋白表达变化，发现HBO暴露18h后HSP70表达达到高峰，随后下降，HSP27和90变化不显著。HBO暴露前给予HSP70拮抗剂槲皮素及NO合酶抑制剂L-NAME （NG-nitro-L-arginine-methyl ester）均可显著抑制HSP70的表达，提示HBO通过NO诱导HSP70的表达。③探索HSP70在HBO预防DCS过程中的作用。以“700kPa-90min空气暴露、3min减压”制备大鼠DCS模型，暴露前18h给予常压空气、HBO（280kPa-60min）、HBO+槲皮素、HBO+L-NAME处理（n=60）。快速减压后1h检测肺和脊髓的氧化损伤水平（MDA、8-OHdG、H2O2）及凋亡情况（caspase3、9及TUNEL凋亡细胞染色），发现DCS模型组氧化损伤及凋亡程度较正常对照明显升高（P<0.05），HBO预暴露显著降低了这些损伤（P<0.05），槲皮素及L-NAME显著拮抗了HBO的保护效应（它们各自单独使用对DCS模型的上述指标无影响）。说明HSP70的抗氧化、抗凋亡作用在HBO预防DCS中发挥了作用。上述结果表明：18h前单次HBO暴露对大鼠DCS有明显的预防作用，此效应与HSP70的抗氧化和抗凋亡作用有关。内皮是DCS中最先受到气泡损伤的组织，离体研究以脐静脉内皮细胞（HUVEC）为对象，从以下三方面展开：①观察HBO预适应对HUVEC表达HSP的影响。细胞以280kPa-60min方案98.2%氧气及1.8%二氧化碳混合气暴露（即280kPa下暴露气体中二氧化碳浓度为5%），分别在暴露后即刻、6、12、18、24、30、36、42h （n=6）收集细胞，通过Western-blot检测HSP27、32、70和90蛋白表达变化，发现HBO暴露18h后HSP70表达达到高峰，HSP27、32和90升高变化不显著。L-NAME或槲皮素均可显著抑制HSP70的表达，提示NO介导了HBO对HSP70的诱导。②HSP70在HBO预防氧化损伤中的作用。将HUVEC暴露于终浓度为250μmol/L的过氧化氢（hydrogen peroxide，H2O2）4h，暴露前18h给予常压空气、HBO（280kPa-60min）、HBO+槲皮素、HBO+L-NAME处理（n=6）。H2O2处理后检测细胞氧化损伤程度（MDA、SOD、GSH-Px）及细胞活力（LDH、CCK8），结果表明H2O2明显地损伤了HUVEC，其氧化损伤指标增高，细胞活性下降（P<0.05），HBO预暴露显著降低了这些损伤（P<0.05），槲皮素及L-NAME显著拮抗了HBO的保护效应（它们各自单独使用对上述指标无影响）。说明HSP70的抗氧化作用在HBO预防细胞氧化损伤中发挥了作用。③阐明HBO诱导HSP70的分子机制。细胞以280kPa-60min方案98.2%氧气及1.8%二氧化碳混合气暴露后，分别在暴露后即刻、6、12、18h收集细胞，通过信号蛋白磷酸化芯片检测Akt、ATF-2、BCR-Abl、CREB、HSP27、ERK、JNK、p38、NF-κB、p53及STAT3通路磷酸化的表达程度，结果表明Akt通路在HBO暴露后12h表达增高，p38通路在暴露后6h增高，当使用p38抑制剂SB203580后，HBO对HSP70的诱导被拮抗了。Akt通路可介导HSP70的表达，说明HBO产生NO后可通过p38及Akt通路诱导HSP70表达增高。以上结果说明HBO预适应可通过p38及Akt通路促进HSP70表达，并通过HSP70的抗损伤作用预防了内皮细胞的氧化损伤。综上所述，18h前单次高压氧预暴露可通过激活Akt及p38通路诱导保护性蛋白HSP70表达增高，通过其抗氧化抗凋亡的作用减轻气泡对组织损伤，发挥DCS预防效应。本课题明确了HBO预防DCS中HSP70通路的作用机制，为进一步探索明确HBO在DCS预防实践中的运用提供了新的依据。

全文目录


摘要  5-8
Abstract  8-11
缩略词表  11-13
前言  13-16
第一部分：高压氧通过诱导热休克蛋白 70预防大鼠减压病的机制  16-42
  一、材料与方法  16-21
  二、实验方法  21-30
  三、实验结果  30-38
  四、讨论  38-42
第二部分：高压氧通过热休克蛋白 70 预防内皮细胞的氧化损伤  42-61
  一、材料  42-45
  二、实验方法  45-52
  三、实验结果  52-57
  四、讨论  57-61
结论  61-62
参考文献  62-67
综述：减压病预防研究进展  67-76
  参考文献  72-76
论文发表情况  76-77
致谢  77

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