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胚胎干细胞源角膜缘干细胞联合脱细胞角膜缘基质修复眼表的研究

作　者: 朱婧
导　师: 吴欣怡
学　校: 山东大学
专　业: 眼科学
关键词: 胚胎干细胞角膜缘干细胞细胞诱导微环境脱细胞支架生物材料角膜缘干细胞移植器官培养组织工程植片
分类号: R779.65
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

角膜缘区是角膜缘干细胞(limbal stem cells, LSCs)的所在之处,也是角结膜间重要的屏障结构,对角膜透明性的维持和正常生理功能的发挥具有重要的作用。严重的眼表疾病可损伤角膜缘区,导致LSCs的缺失及屏障结构的破坏,从而引起一系列眼表反应,甚至导致失明。目前,LSCs移植是主要的治疗方法。但LSCs供体的匮乏使其应用受到限制。组织工程角膜缘移植物有望为这一问题的解决提供新的思路,其是将体外培养的种子细胞接种于支架材料上所构建的与天然角膜缘植片结构和功能较为相似的组织替代物。充足的种子细胞和适宜的支架材料是组织工程角膜缘移植物构建的两大关键。角膜上皮暴露于眼表易于受损,理想的LSCs替代来源应有较强的自我更新能力。胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESCs)因其所具有的强大增殖能力和分化全能性可作为一种良好的种子细胞来源,为组织工程植物物提供无限的细胞供给。现阶段国内外ESCs定向诱导在眼表研究方面多关注于终末角膜上皮细胞的分化,但角膜上皮细胞的增殖分化潜能有限。因此如能将ESCs在体外分化为增殖能力更强的LSCs样细胞,可为组织工程角膜缘移植物的构建提供更为理想的种子细胞来源。角膜缘区独特的组织结构及基底膜成分是LSCs特性维持的重要基础。人角膜缘基质是构建组织工程角膜缘植片的最佳支架材料,但同样受到供体来源匮乏的限制。近年来,天然生物材料因其与正常组织近似的结构特性及成分构成,成为组织工程领域的研究热点。本实验室前期研究证实：0.5%十二烷基磺酸(Sodium Dodecyl Sulfate, SDS)脱细胞法可完全脱除猪角膜中的细胞成分,并保存角膜基质正常的胶原排列与基底膜结构。脱细胞猪角膜缘基质(acellular porcine limbal matrix, APLM)保留了角膜缘基质特有的三维结构,可用于角膜缘基质缺损的修补。但APLM能否作为良好的LSCs体外扩增载体及移植负载材料仍需进一步的研究。因此,本研究首先探讨了将人ESCs定向诱导分化为LSCs样细胞的可行性,并筛选优化了诱导方案,诱导细胞具有与人LSCs相似的形态及表型,增殖能力良好,可进一步分化为角膜上皮细胞样细胞；其次通过分析APLM基底膜成分,证实APLM可支持人LSCs的粘附生长及干细胞特性的维持,可作为良好的LSCs体外扩增载体及移植负载材料；最后,我们利用人ESCs来源LSCs样细胞联合APLM构建了组织工程LSCs移植物,并进行了初步的动物移植实验,结果显示构建物在重建角膜缘结构及修复损伤眼表方面具有一定的作用。第一部分人胚胎干细胞诱导分化为角膜缘干细胞样细胞的实验研究[目的]探讨体外诱导人ESCs定向分化为LSCs样细胞的可行性并筛选优化诱导方案。[方法]1.人ESCs的培养及鉴定：将丝裂霉素C处理过的胚鼠成纤维细胞按5×104细胞/cm2密度接种于35mm细胞培养皿内备用。于解剖显微镜下将人ESCs克隆团分割成小块,按100个克隆团／皿接种于胚鼠成纤维细胞饲养层上,常规培养；每6天机械法传代。利用免疫细胞荧光检测人ESCs标记物OCT-4和SSEA-3的表达。2.人LSCs的原代培养及鉴定：将丝裂霉素C处理过的3T3鼠成纤维细胞按2.4×104细胞/cm2密度接种于35mm细胞培养皿内备用。无菌条件下去除人角膜缘环残余结膜和葡萄膜组织,撕去角膜内皮。将剩余组织块置于2.4U/mldispaseⅡ内37℃消化1.5小时,刮取角膜缘上皮,0.25%胰酶-0.02%EDTA消化10分钟,使用DMEM/F12配制的LSCs培养基(DMEM/F12-LSCs培养基)或MCDB151配制的LSCs培养基(MCDB151-LSCs培养基)重悬细胞,按5×103细胞/cm2密度接种于3T3饲养层细胞上,常规培养,隔日给予新鲜的DMEM/F12-LSCs培养基或MCDB151-LSCs培养基。利用免疫细胞荧光检测人LSCs标记物p63α、ABCG-2和角膜上皮细胞标记物CK12的表达。3.条件培养基的配制：待LSCs克隆团边缘开始融合时,按200μL/cm2分别加入新鲜DMEM/F12-LSCs培养基或MCDB151-LSCs培养基,每24小时收集细胞培养上清液,连续5天,将收集好的上清液用0.22μm滤器过滤后-80℃保存备用。将收集的培养基上清液与同种新鲜LSCs培养基分别按照3：1,1：1和1：3的比例混合配制成上清液浓度分别为75%,50%和25%的DMEM/F12-LSCs条件培养基或MCDB151-LSCs条件培养基,4℃保存备用。收集单独培养3T3细胞的DMEM/F12-LSCs培养基上清液与MCDB151-LSCs培养基上清液与同种新鲜LSCs培养基按照1：1比例混合配制成DMEM/F12-3T3条件培养基及MCDB151-3T3条件培养基,作为对照使用。4.人ESCs的定向诱导及标记物的鉴定：机械法分割人ESCs克隆团,移入35mmm低粘附细胞培养皿内采用拟胚体培养基悬浮培养5天,即获得球形的拟胚体。将拟胚体接种于预包被Ⅳ性胶原的35mm细胞培养皿内,分别给予配置好的不同浓度的条件培养基常规培养12天。根据所加入条件培养基的种类及浓度不同,分别将诱导细胞命名为75%DMEM/F12-LSCs条件培养基组(75DF),50%DMEM/F12-LSCs条件培养基组(50DF),25%DMEM/F12-LSCs条件培养基组(25DF),75%MCDB151-LSCs条件培养基组(75M),50%MCDB151-LSCs条件培养基组(50M),25%MCDB151-LSCs条件培养基组(25M),及DMEM/F12-3T3条件培养基组(DF-3T3)、MCDB151-3T3条件培养基组(M-3T3)。利用实时定量聚合酶链式反应和免疫细胞荧光检测各组诱导细胞内p63α、ABCG-2及CK12的表达,筛选优化诱导方案。5、诱导细胞克隆形成能力及分化水平的检测：将诱导细胞接种于3T3饲养层上,每隔10天进行传代,直至镜下观察无明显克隆团形成为止。利用Giemsa染色法检测不同代间诱导细胞的克隆形成能力。利用免疫细胞荧光比较不同代间诱导细胞内p63α、ABCG-2及CK12的表达情况。[结果]人ESCs与原代人LSCs均可在饲养层上形成克隆团样结构,并表达各自特征性的细胞标记物。诱导实验结果显示：更换条件培养基24小时后,拟胚体即贴壁生长。75DF组内细胞逐渐转变为多边形上皮样细胞,大小形态均一,呈铺路石样,9天后局部可见复层细胞结构。MCDB151-LSCs条件培养基组自第9天起克隆团边缘出现类神经样细胞,细胞形态出现差异,差异性随条件培养基浓度降低而增高。实时定量聚合酶链式反应和免疫细胞荧光检测结果表明诱导细胞于第9天出现ABCG-2、p63α表达高峰,其中75DF组表达量明显高于其余各组；诱导前9天CK12表达量维持较低水平,12天时开始升高。免疫细胞荧光计数显示75%DMEM/F12-LSCs条件培养基的诱导效率最高,培养9天时,约80%的诱导细胞表达ABCG-2,超过40%的细胞呈p63α阳性。体外扩增实验显示诱导细胞可连续传代4代以上。随传代次数增加,细胞内CK12表达上调,呈角膜上皮细胞表型。[结论]通过条件培养基体外模拟角膜缘微环境,可将人ESCs诱导分化为LSCs样细胞。第二部分脱细胞猪角膜缘基质的制备及生物学特性检测[目的]探讨APLM作为人LSCs体外扩增载体及移植负载材料的可行性。[方法]1. APLM及APCM的制备：无菌条件下切取新鲜猪角巩膜缘(含1mm巩膜,2mm外周角膜)及中央角膜(直径7.5mm)组织,置于0.5%SDS溶液中4℃脱细胞24小时。无菌磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline, PBS)漂洗脱细胞组织16小时,去除SDS。切取含前弹力层的脱细胞角巩膜缘基质及脱细胞角膜基质(厚约0.5mm),即获得APLM与APCM支架。2.脱细胞羊膜(denuded amniotic membrane, DAM)的制备：无菌条件下将新鲜羊膜修剪成5cm×5cm的小块,上皮面朝上平铺于无菌乙酸纤维素薄膜,置于1：1的甘油-DMEM溶液中-144℃冰箱保存。使用前于室温解冻水化30分钟,加入0.25%胰酶-0.02%EDTA37℃消化1h后,小心刮除羊膜上皮细胞,根据需要修剪大小,即为DAM支架。3.支架材料的形态学及免疫学检测：HE染色及DAPI染色检测APLM、APCM及DAM支架材料中细胞脱除情况。采用免疫组织荧光方法分析比较APLM、 APCM、DAM及正常人角膜缘基底膜中collagen Ⅳ a2, laminin β1, perlecan, agrin, laminin a2, lamininγ3, tenascin-C的表达情况。4.组织工程LSCs植片的构建及其形态功能的检测：将APLM、APCM及DAM置于DMEM/F12-LSCs培养基内37℃浸泡24小时,基底膜面向上置于24孔板内。将生长状态良好的人LSCs消化离心制成细胞悬液,按细胞密度1.5×103细胞/mm2接种于APLM、APCM及DAM表面,待细胞贴壁后补足培养基至支架表面被浸没。常规培养21天后,通过HE染色检测组织形态,利用免疫组织荧光检测及实时定量聚合酶链式反应检测接种细胞内ABCG-2、p63α及CK12的表达。[结果]HE染色及DAPI染色显示APLM、APCM及DAM支架中未见细胞成分残留,材料内胶原排列及基底膜结构保留完好。免疫组织荧光检测表明人角膜缘组织、APLM及DAM基底膜均高表达collagen Ⅳα2、laminin β1、perlecan及agrin;APCM基底膜中可见perlecan高表达,collagen IV a2和lamininβ1微弱表达,未观察到agrin表达。人角膜缘区基底膜特异性标记物laminin α2、laminin γ3和tenascin-C在APLM基底膜均高表达；APCM和DAM内未观察到三者的表达。接种LSCs在APLM、APCM及DAM表面均可形成排列紧密的复层上皮细胞样结构。APLM上可见4-5层细胞-底层细胞呈矮柱状,排列紧密,表层细胞呈扁平状,与正常角膜缘细胞结构近似。接种细胞于APCM上可形成2-3层细胞,底层未见矮柱状细胞。DAM上扩增的细胞达5-6层,细胞体积较大,排列紧密,表层为扁平状细胞,基底部无明显矮柱状细胞。免疫组织荧光检测证实APCM及DAM上的细胞广泛表达CK12,但ACBG-2及p63α表达较弱。APLM上扩增的细胞：基底部细胞层高表达ABCG-2及p63α, CK12表达则多集中于表层细胞。实时定量聚合酶链式反应检测显不APLM接种细胞内p63α、ABCG-2的表达量约为DAM或APCM接种细胞的2倍, CK12的表达量仅为后两者的40%。[结论]APLM基底膜具有与人角膜缘基底膜相似的成分构成,可良好支持人LSCs的体外扩增及干细胞特性的维持。第三部分脱细胞猪角膜缘基质联合人胚胎干细胞来源角膜缘干-细胞构建角膜缘移植物修复损伤眼表的初步研究[目的]探讨人ESCs来源LSCs样细胞联合APLM构建角膜缘移植物,重建角膜缘微环境及修复损伤眼表的可行性。[方法]1.组织工程角膜缘移植物的构建：采用75%DMEM/F12-LSCs条件培养基诱导人ESCs9天,将诱导细胞按细胞密度1.5×103细胞/mm2接种于APLM及DAM表面。常规培养21天,通过HE染色检测植片组织形态。2.组织工程角膜缘移植物的移植实验：采用角膜缘干细胞组织切除联合角膜上皮化学烧伤法建立LSCs失代偿动物模型,即用3%戊巴比妥钠麻醉实验用兔,板层切除角膜缘组织,正-庚醛去除中央角膜上皮,1月后根据角膜混浊、新生血管及荧光素染色情况对损伤眼表进行评分,各项评分≥2者,即为LSCs失代偿。将15只LSCs失代偿兔,随机分为3组,每组5只。A组：移植人ESCs来源LSCs联合APLM构建的组织工程植片；B组：移植人ESCs来源LSCs联合DAM构建的组织工程植片；C组：移植APLM支架材料。术后每日给予典必殊眼水3次,典必殊眼膏1次,定期裂隙灯下观察眼表修复情况,1月后行病理检查。[结果]诱导细胞可于APLM及DAM表面形成4-5层细胞,细胞排列紧密,APLM复层细胞结构中底层细胞呈矮柱状,表层细胞则呈扁平状。移植术后1周,各组球结膜充血明显,角膜混浊水肿。术后2周,A、B组炎症反应减轻,角膜水肿有所消退,B组可见羊膜降解；C组角膜仍明显水肿。移植术后1个月,A组角膜透明度明显改善,荧光素染色阴性,仅角膜缘区可见少量新生血管；B组角膜透明度有所改善,荧光素染色阴性,可见少量新生血管长入；C组角膜新生血管及角膜混浊明显,角膜结膜化,荧光素染色阳性。HE染色显示A组角膜上皮结构完整；B组上皮结构中可见部分空泡状杯状细胞；C组则未见连续角膜上皮结构。[结论]人ESCs来源LSCs样细胞联合APLM构建的角膜缘移植物在重建角膜缘结构及修复损伤眼表方面具有一定的作用。

全文目录

中文摘要  8-15
ABSTRACT  15-24
符号说明  24-25
前言  25-34
  参考文献  28-34
第一部分人胚胎干细胞诱导分化为角膜缘干细胞样细胞的实验研究  34-59
  材料和方法  35-46
  结果  46-48
  讨论  48-50
  结论  50-51
  附图  51-56
  参考文献  56-59
第二部分脱细胞猪角膜缘基质的制备及生物学特性检测  59-81
  材料与方法  60-68
  结果  68-69
  讨论  69-70
  结论  70-71
  附图  71-76
  参考文献  76-81
第三部分脱细胞猪角膜缘基质联合人胚胎干细胞来源角膜缘干细胞构建角膜缘移植物修复损伤眼表的初步研究  81-96
  材料和方法  82-85
  结果  85
  讨论  85-86
  结论  86-88
  附图  88-91
  参考文献  91-96
文献综述  96-106
  参考文献  101-106
致谢  106-107
攻读学位期间发表论文及获奖情况  107-108
学位论文评阅及答辩情况表  108-109
英文论文  109-153

胚胎干细胞源角膜缘干细胞联合脱细胞角膜缘基质修复眼表的研究

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