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Ahil基因突变导致Joubert综合征的相关疾病机理研究

作　者: 翁翎
导　师: 唐北沙; 李晓江
学　校: 中南大学
专　业: 临床医学
关键词: Joubert综合征 Abelson helper integration site-1(Ahi1) 亨廷顿-相关蛋白1(Hap1) CEND1/BM88 Ahi1基因敲除小鼠 神经生长
分类号: R748
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


Joubert综合征(Joubert syndrome, JBTS)是一种十分少见的常染色体隐性遗传神经系统发育迟滞疾病。研究发现,Abelson helper integration site-1(AHI1)基因突变可导致N-端Ahi1蛋白片段形成,并导致Joubert综合征。但是AHI1基因突变引起发育迟滞的机制尚不明确。本研究发现,亨廷顿-相关蛋白1(Hap1),一种对出生后幼鼠存活率起关键作用的蛋白,可与全长Ahi1蛋白相结合,而不能与N-端Ahi1蛋白片段结合。这一Ahi1-Hap1结合在神经分化过程中受到神经生长因子(NGF)的调控。NGF诱导Hap1A的去磷酸化,并降低其与Ahi1的结合,同时Hap1A在神经突起末端的分布增多。对小鼠脑组织蛋白的分析也表明,Ahi1在胞浆而非突触部分与磷酸化的Hap1A结合,提示Ahi1主要在神经元胞体发挥生理作用。对小鼠脑组织胞浆成分进行抗Ahi1抗体免疫共沉淀后的质谱分析发现,除Hap1外,Ahi1还与CEND1/BM88蛋白结合。CEND1/BM88是一种特异表达于神经元的蛋白,参与调控神经分化和神经发生,在出生后小鼠的脑组织中高度表达。在Ahil基因敲除小鼠的下丘脑组织中,Ahil蛋白的缺失导致CEND1/BM88水平下降,小鼠发育迟滞。而在N2a细胞中过表达Ahil则能稳定CEND1/BM88。此外,对Ahil基因敲除小鼠下丘脑神经元进行原代培养发现,神经元的突起较野生型减少,长度较短。而在该原代神经元中过表达CEND1/BM88则可促进其神经元突起生长。本研究的发现提示,在早期发育过程中,CEND1/BM88参与Ahil相关的下丘脑神经元分化。上述发现对于研究Jourbert综合征中出现的发育迟滞的相关病理机制提供了新的思路。图27幅,表3个,参考文献79篇。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-8
目录  8-12
第一章 磷酸化对Ahi1与Hap1A相互作用影响的机理研究  12-40
  前言  12-13
  第一节 神经营养因子对Hap1A磷酸化的影响研究  13-26
    1 仪器与材料  13-16
      1.1 研究对象  13
      1.2 主要仪器与试剂  13-16
        1.2.1 主要试验仪器  13
        1.2.2 主要试剂与耗材  13-15
        1.2.3 主要试剂的配置  15-16
    2 实验方法  16-22
      2.1 PC12细胞培养  16-18
        2.1.1 培养条件  16-17
        2.1.2 细胞传代  17
        2.1.3 细胞冻存  17-18
        2.1.4 细胞的冻融(复苏)  18
      2.2 各种神经营养因子刺激  18
      2.3 蛋白样品的制备  18
      2.4 样品蛋白浓度测定  18-19
      2.5 Western Blotting步骤  19-21
      2.6 PC12细胞的免疫荧光步骤  21-22
    3 结果  22-24
      3.1 不同的神经营养因子通过不同的信号通路调节Hap1A的磷酸化  22-23
      3.2 NGF处理后Hap1A和Ahi1在细胞中的分布  23-24
    4 分析和讨论  24-25
    5 结论  25-26
  第二节 Hap1A磷酸化对Ahi1与Hap1A相互作用的影响研究  26-40
    1 仪器与材料  26-30
      1.1 研究对象  26
      1.2 主要仪器与试剂  26-30
        1.2.1 主要试验仪器  26-27
        1.2.2 主要试验试剂与耗材  27-28
        1.2.3 主要试剂的配置  28-30
    2 实验方法  30-36
      2.1 PC12细胞培养  30-31
        2.1.1 培养条件  30
        2.1.2 细胞传代  30-31
      2.2 NGF刺激和细胞蛋白样品的制备  31
      2.3 细胞转染  31-32
      2.4 小鼠蛋白样品的制备  32
      2.5 免疫共沉淀  32-33
      2.6 亚细胞分离  33-34
      2.7 Western Blotting步骤  34-35
      2.8 PC12细胞的免疫荧光步骤  35-36
    3 结果  36-38
    4 分析和讨论  38-39
    5 结论  39-40
第二章 Ahi1基因敲除小鼠模型的构建及行为学  40-58
  第一节 Ahi基因敲除小鼠模型的构建  40-51
    1 仪器与材料  40-44
      1.1 研究对象  40
      1.2 主要仪器与试剂  40-44
        1.2.1 主要试验仪器  40-41
        1.2.2 主要试验试剂与耗材  41-42
        1.2.3 主要溶液的配置  42-44
    2 实验方法  44-48
      2.1 实验技术路线  44
      2.2 Ahi1基因敲除小鼠基因型鉴定  44-46
        2.2.1 小鼠基因组DNA的提取  44-45
        2.2.2 引物设计  45
        2.2.3 PCR反应体系（表2-1,表2-2)  45-46
        2.2.4 rCR反应条件  46
        2.2.5 PCR扩增产物检测  46
      2.3 小鼠蛋白样品的制备  46-47
      2.4 Western Blotting步骤  47-48
    3 结果  48-49
    4 讨论  49-50
    5 结论  50-51
  第二节 Ahi基因敲除小鼠模型的行为学研究  51-58
    1 仪器与材料  51
      1.1 研究对象  51
      1.2 主要试验仪器  51
    2 实验方法  51-53
      2.1 小鼠体重及形态学观察  51
      2.2 小鼠自主活动实验(Locomotor Activity)  51
      2.3 小鼠强迫游泳实验(Forced Swim Test,FST)  51-52
      2.4 小鼠悬尾实验(Tail Suspension Test)  52-53
      2.5 小鼠滚轮实验(Rotarod Test)  53
      2.6 统计方法  53
    3 结果  53-56
    4 讨论  56-57
    5 结论  57-58
第三章 Ahi1通过调节其互作蛋白CEND1介导神经分化的研究  58-90
  第一节 Ahi1互作蛋白的筛查  58-68
    1 仪器与材料  58-61
      1.1 研究对象  58
      1.2 主要仪器与试剂  58-61
        1.2.1 主要试验仪器  58-59
        1.2.2 主要试验试剂与耗材  59-60
        1.2.3 主要溶液的配置  60-61
    2 实验方法  61-65
      2.1 实验技术路线  61-62
      2.2 小鼠蛋白样品的制备  62
      2.3 免疫共沉淀  62-63
      2.4 质谱分析  63
      2.5 Western Blotting步骤  63-65
    3 结果  65-67
    4 讨论  67
    5 结论  67-68
  第二节 Ahi1 KO小鼠中CEND1表达量的检测  68-77
    1 仪器与材料  68-71
      1.1 研究对象  68
      1.2 主要仪器与试剂  68-71
    2 实验方法  71-74
      2.1 小鼠蛋白提取  71
      2.2 Western Blotting  71-73
      2.3 小鼠标本取材及切片的制备  73-74
      2.4 小鼠脑片的免疫荧光  74
    3 结果  74-76
    4 结论  76-77
  第三节 Ahi1与CEND1相互作用及其对神经突起分化的影响  77-90
    1 仪器与材料  77-81
      1.1 研究对象  77
      1.2 主要仪器与试剂  77-81
        1.2.1 主要试验仪器  77-78
        1.2.2 主要试剂与耗材  78-79
        1.2.3 主要溶液的配置  79-81
    2 实验方法  81-85
      2.1 细胞培养条件  81
        2.1.1 PC12细胞的培养条件  81
        2.1.2 N2A细胞的培养条件  81
      2.2 小鼠下丘脑原代神经元培养  81-82
      2.3 细胞转染及NGF处理,Cend1半衰期实验  82
      2.4 Western Blotting  82-84
      2.5 细胞免疫荧光步骤  84-85
    3 结果  85-88
      3.1 Ahi1蛋白稳定Cend1水平  85
      3.2 Cend1的表达能减轻Ahi1突变引起的神经元分化异常  85-88
    4 讨论  88-90
结论  90-91
参考文献  91-98
综述  98-117
  参考文献  106-117
攻读学位期间主要的研究成果  117-118
致谢  118-119

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中图分类: > 医药、卫生 > 神经病学与精神病学 > 神经病学 > 儿童神经病
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