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MAGE-A9通过Efp/14-3-3σ通路参与乳腺癌内分泌治疗耐药的机制研究

作　者: 周欣亮
导　师: 单保恩; 艾军
学　校: 河北医科大学
专　业: 临床检验诊断学
关键词: 乳腺癌 ER 阳性 MAGE-A9 Efp 14-3-3σ 结构域缺失突变体
分类号: R737.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

目的：内分泌治疗是雌激素受体（estrogen receptor, ER）阳性乳腺癌患者综合治疗最有效的方法之一。然而，目前临床上约40%的ER阳性乳腺癌患者对内分泌治疗产生耐药，这已经成为乳腺癌治疗的严重障碍。在乳腺癌中，ER的下游靶蛋白在介导雌激素活性方面发挥作用，其中雌激素反应性指蛋白(Estrogen-responsive finger protein, Efp)是非常重要的的一个。Efp作为一种含有RING(Really interesting new gene)结构域的E3泛素连接酶，可通过泛素途径降解细胞周期负调控因子14-3-3σ，该途径是ER阳性乳腺癌患者内分泌治疗耐药的重要原因之一。最近的研究显示，黑色素瘤抗原(Melanoma-associated antigen, MAGE)家族可与E3泛素连接酶中的RING结构域蛋白相互作用，并调控其泛素酶活性。本研究旨在通过研究MAGE-A9对Efp-14-3-3σ泛素化通路的影响，阐明其在雌激素依赖型乳腺癌内分泌治疗耐药中的作用机制，为解决雌激素受体(Estrogen receptors,ER)阳性乳腺癌患者内分泌治疗耐药问题提供新的理论依据和实验数据。方法：1应用免疫组织化学方法检测60例ER阳性乳腺癌患者乳腺癌组织中MAGE-A9、Efp和14-3-3σ蛋白表达状况，并分析其表达之间的关系。2利用基因转染、RT-PCR及Western-Blot方法研究外源性MAGE-A9对Efp介导的14-3-3σ降解的影响。3利用基因转染和免疫沉淀技术(Immunoprecipitation， IP)检测MAGE-A9与Efp之间的蛋白相互作用。4构建MAGE-A9结构域缺失突变体，并利用MTT及克隆形成实验的方法检测各结构域对MCF-7细胞增殖的影响。结果：160例ER阳性乳腺癌组织中有27例MAGE-A9蛋白表达阳性，阳性率为45.0%；有41例Efp表达阳性，阳性率为68.3%；有9例14-3-3σ蛋白表达阳性，阳性率为15.0%。27例MAGE-A9蛋白表达阳性的患者中19例为Efp表达阳性（19/27；70.1%)；33例MAGE-A9蛋白表达阴性的患者中22例为Efp表达阳性（22/33；66.7%)，此结果表明Efp的表达与MAGE-A9蛋白的表达没有相关性(χ~2=0.094, P=0.759)。27例MAGE-A9蛋白表达阳性的患者中没有患者呈14-3-3σ蛋白表达阳性(0/27)，但在33例MAGE-A9蛋白表达阴性的患者中，14-3-3σ蛋白表达阳性的患者9例，占27.3%(9/33)。由此可见，14-3-3σ的表达随着MAGE-A9蛋白表达的增加而降低(χ~2=6.656, P=0.01)。41例Efp表达阳性患者中仅有2例为14-3-3σ表达阳性（2/41；4.9%)，但在19例Efp表达阴性的患者中，14-3-3σ蛋白表达阳性的患者7例(7/19；36.8%)。因此，14-3-3σ的表达随着Efp蛋白的表达的增加而降低(χ~2=8.0748，P=0.005)。2RT-PCR结果显示单独转染14-3-3σ表达载体、共转14-3-3σ和Efp表达载体、共转14-3-3σ、MAGE-A9与Efp到乳腺癌细胞株MCF-7细胞之后，三组比较14-3-3σ的mRNA表达量没有明显差异。Western-Blot结果显示，在14-3-3σ过表达的情况下，转染Efp可以降低14-3-3σ的蛋白表达量，共转MAGE-A9与Efp之后，14-3-3σ的表达量与单独转染Efp组相比显著减低。3在MCF-7细胞中共转染Efp和MAGE-A9表达载体之后，免疫共沉淀分析结果显示二者之间存在蛋白相互作用。4成功构建Myc-His-pcDNA3.1(-)MAGE-A9结构域缺失突变体：Myc-His-pcDNA3.1(-)MAGE-A9(1-29)、Myc-His-pcDNA3.1(-)MAGE-A9(1-114)、Myc-His-pcDNA3.1(-)MAGE-A9(115-285)和Myc-His-pcDNA3.1(-)MAGE-A9(286-315)。5四种MAGE-A9结构域缺失突变体转染到乳腺癌细胞MCF-7中，RT-PCR和Western-Blot结果显示均能成功表达。6克隆形成实验显示：空白载体Myc-His-pcDNA3.1(-)组、Myc-His-pcDNA3.1(-)MAGE-A9(1-29)组、Myc-His-pcDNA3.1(-)MAGE-A9(1-114)组、Myc-His-pcDNA3.1(-)MAGE-A9(115-285)组和Myc-His-pcDNA3.1(-)MAGE-A9(286-315)组的克隆形成率分别是(30.00±0.93%)、(20.35±0.89%)、(23.00±0.90%)、(72.50±1.99%)和(22±1.03%)。由此可见Myc-His-pcDNA3.1(-)MAGE-A9(115-285)组克隆数明显高于其余四组(P＜0.05)，而其余四组间无显著差异(P＞0.05)。7MTT结果显示，将MAGE-A9结构域突变体转染到MCF-7细胞后，接种24小时和48小时，空载体Myc-His-pcDNA3.1(-)组、Myc-His-pcDNA3.1(-)MAGE-A9(1-29)组、Myc-His-pcDNA3.1(-)MAGE-A9(1-114)组、Myc-His-pcDNA3.1(-)MAGE-A9(115-285)组和Myc-His-pcDNA3.1(-)MAGE-A9(286-315)细胞的生存率分别为(100.00%和100.00%)、(102.85%和108.50%)、(98.72%和95.51%)、(147.86%和228.61%)和(98.74%和100.00%)。转染Myc-His-pcDNA3.1(-)MAGE-A9(115-285)组的增殖状况与其余四组相比明显增高(P＜0.01)。结论：1在ER阳性乳腺癌患者的乳腺癌组织中14-3-3σ蛋白表达与Efp及MAGE-A9都存在负相关关系。2MAGE-A9可通过与Efp的蛋白相互作用，在转录后水平上促进Efp介导的14-3-3σ蛋白的降解。3MAGE-A9结构域突变体中Myc-His-pcDNA3.1(-)MAGE-A9(115-285)能够能促进MCF-7细胞的增殖。

全文目录

摘要  4-7
ABSTRACT  7-11
引言  11-12
第一部分肿瘤抗原 MAGE-A9、Efp 和 14-3-3σ在 ER 阳性乳腺癌患者癌组织中的表达及其表达之间的关系  12-26
  前言  12-13
  材料和方法  13-15
  结果  15-17
  附图  17-20
  附表  20-21
  讨论  21-22
  小结  22
  参考文献  22-26
第二部分外源性 MAGE-A9 对 Efp 介导的 14-3-3σ表达影响的研究  26-59
  前言  26-27
  材料与方法  27-40
  结果  40-43
  附图  43-53
  附表  53-55
  讨论  55-57
  小结  57
  参考文献  57-59
结论  59-60
综述 MAGE-A 家族：肿瘤免疫治疗的靶点  60-74
  参考文献  67-74
致谢  74-75
个人简历  75-76

MAGE-A9通过Efp/14-3-3σ通路参与乳腺癌内分泌治疗耐药的机制研究

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