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人源性抗乳腺癌HER-2噬菌体单链抗体库的构建与筛选

作　者: 王志文
导　师: 陈昌杰
学　校:
专　业: 临床检验诊断学
关键词: 噬菌体抗体库单链抗体 HER-2 噬菌体展示乳腺癌
分类号: R737.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的：构建大容量的人源性抗乳腺癌噬菌体单链抗体库,从中筛选出抗乳腺癌HER-2特异性单链抗体,并对其进行鉴定。方法：[1]取经临床确诊的乳腺癌患者癌旁淋巴组织,提取总RNA,并设计可变区引物；[2)通过RT-PCR方法,扩增抗体轻重链可变区基因,并连入T载体,构建可变区基因的T载体库；[3]设计Linker序列,合成Linker模板,并连入pCANTAB-5E载体,构建pCANTAB-Linker;(4)将VH和VL可变区基因与pCANTAB-Linker拼接,得到pCANTAB-scFv,电转化感受态大肠杆菌T61；[5]收集转化后菌落,加入M13K07辅助噬菌体进行感染,收集噬菌体上清即为噬菌体抗体库；[6]噬菌体抗体库先经低表达HER-2的乳腺癌细胞株MCF-7进行吸附,再通过高表达HER-2的乳腺癌SKBR3细胞株进行淘洗筛选；[7]用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测噬菌体抗体的活性,并用免疫组织化学方法检测抗体亲和力及测序进行鉴定。结果：(1)通过RT-PCR方法,扩增出VH区基因片段约375bp,VL区基因片段约330bp,并连入T载体,构建可变区基因T载体库；[2]成功构建pCANTAB-Linker,并通过酶切连接,将轻重链可变区基因拼接,成功构建pCANTAB-scFv,获得scFv的长度为750bp；(3]电转化E.coli TG1,在含有青霉素的平板上长出阳性菌落,抽提质粒并进行酶切验证插入片段大小正确,插入率为80%,并计算库容得到库容为2.4×108的大容量抗体库；[4)通过噬菌体展示的方法,经过高表达HER-2的乳腺癌SKBR3细胞株进行4轮淘洗筛选,富集针对乳腺癌SKBR3细胞表面抗原的抗体库；[5]通过酶联免疫吸附试验(ELISA)证实所得抗体对HER-2抗原有良好亲和力和高度的特异性,免疫组化结果显示阳性克隆对乳腺癌组织HER-2抗原有较高亲和力；[6]测序结果表明,所得到单链抗体基因与人IgG抗体进行对比,具有高度的人源性。结论：本研究主要利用基因工程和噬菌体展示技术构建人源性抗乳腺癌细胞的噬菌体单链抗体库,再通过多轮筛选,获得能特异性识别人乳腺癌HER-2的高亲和力单链抗体,并通过ELISA.免疫组织化学及测序等方法,对抗体的结构和功能进行初步鉴定分析。为乳腺癌的分子诊断及靶向治疗提供新的思路和奠定良好的基础,同时也为以HER-2为靶点的融合蛋白抗肿瘤疗法提供载体。

全文目录

目录  4-5
摘要  5-7
Abstract  7-9
引言  9-13
材料与方法  13-16
  1. 主要试剂和材料  13-14
  2. 仪器  14-15
  3. 组织来源  15
  4. 隨菌粒及菌株  15-16
实验方法  16-27
  1. 总RNA的提取  16-17
  2. 构建可变区基因T载体库  17-21
  3. pCANTAB-Linker载体的改造  21-22
  4. 噬菌体抗体库的构建  22-25
  5. 噬菌体scFv抗体的富集、筛选  25
  6. 筛选后scFv基因的初步鉴定  25-27
实验结果  27-35
  1. 确定RNA质量  27
  2. 轻重链基因片段的扩增  27-28
  3. 可变区基因连接T载体,插入率验证  28-29
  4. Linker模板合成及PCANTAB-Linker构建鉴定  29
  5. scFv构建及重组率测定  29
  6. 抗体库库容估算  29-30
  7. SKBR3细胞对单链抗体的富集  30
  8. ELISA验证单链抗体与HER-2抗原结合活性  30-31
  9. scFv抗体的免疫组化验证  31-32
  10. 筛选后序列分析  32-35
讨论  35-38
结论  38-39
参考文献  39-44
致谢  44-45
附录A 主要英文缩略词简表  45-46
附录B 个人简介  46
附录C 已发表论文  46-47
附录D 综述  47-54
  参考文献  52-54

人源性抗乳腺癌HER-2噬菌体单链抗体库的构建与筛选

内容摘要

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