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糖尿病大鼠玻璃体腔移植不同浓度人脐带间充干细胞的实验研究

作　者: 郑丹
导　师: 陈松
学　校: 天津医科大学
专　业: 眼科学
关键词: 糖尿病视网膜病变人脐带间充质干细胞神经生长因子干细胞治疗
分类号: R774.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的观察玻璃体腔移植不同浓度人脐带间充质干细胞(human umbilical mesenchymal stem cells, hUCMSCs)后糖尿病(diabetes mellitus, DM)大鼠视网膜功能变化及视网膜神经生长因子(nerve growth factor, NGF)的表达情况,观察比较移植不同浓度hUCMSCs对糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)治疗的疗效差异,进一步证明治疗DR的最佳hUCMSCs浓度,探讨hUCMSCs治疗DR的可能机制。方法健康成年雄性SD大鼠48只,随机分成正常对照组(A组)和DM组,分别为10、38只。链脲佐菌素(streptozocin, STZ)尾静脉注射制作SD大鼠DR模型。将DM组大鼠随机分为DR组(B组)、玻璃体腔注射高浓度(1*10^,6～7)hUCMSCs2μL组(C组),玻璃体腔注射低浓度(1*10^5～6)hUCMSCs2μL组(D组),玻璃体腔注射安慰剂2μL组(E组)。正常对照组(A组,10只)和B组无处理。成模后每2-4w进行血糖监测。用溴化乙锭(Evans blue, EB)染色视网膜铺片,荧光显微镜观察视网膜血管的变化情况：苏木精-伊红(HE)染色,光学显微镜下观察视网膜形态学变化；免疫组织化学法观察视网膜NGF阳性染色的情况,Image-Pro Plus6.0图像处理分析软件分析各组染色区的平均累积光密度(integrated optic density, IOD);用实时荧光定量PCR (RT-PCR)检测视网膜中NGF mRNA的相对表达量。采用SPSS17.0统计软件,组间数据比较采用独立样本t检验、单因素方差分析、LSD-t检验进行统计学分析,P<0.05为差异具有统计学意义。结果1.血糖水平监测：STZ尾静脉注射一周后,测得正常对照组大鼠平均血糖值为(5.43±0.81) mmol/L,糖尿病组大鼠血糖值为(27.59±3.56) mmol/L.在不同时间点测得DM大鼠血糖水平较高,但基本保持在一个稳定水平；与同期正常对照组大鼠相比差异均有统计学意义(P均<0.01)2.体质量监测：大鼠造模成功时体质量于正常对照组大鼠相似,二者比较差异无统计学意义(t=0.805,P=0.433)。造模成功后正常对照组大鼠随着周龄的增加体质量增长较快,DM大鼠体质量增长速度较正常对照组减缓,周龄越长,体质量相差越大,不同时间点测得两组体质量差异均有统计学意义(P均<0.01)。3.EB染色视网膜铺片：A组正常大鼠视网膜血管走形良好,血管管壁平滑,视网膜浅层大血管及深层血管网均清晰可见,未见视网膜微血管瘤和视网膜新生血管形成。DM大鼠视网膜血管走形迂曲、扩张,视网膜上可见微动脉瘤,血管呈串珠样改变,血管周围可见高荧光渗漏及周边视网膜可见大片无灌注区。4.HE染色：A组正常大鼠视网膜各层结构整齐分明,细胞形态基本正常。内界膜完整清晰；神经纤维层(nerve fiber layer, NFL)较稀疏呈水平排列；神经节细胞层(ganglion cell layer, GCL)排列整齐,胞核较大,呈圆形或椭圆形,染色较淡；内丛状层(inner plexiform layer, IPL)较厚,呈较明显的网状结构；内核层(inner nuclear layer, INL)细胞胞核较大,染色稍深；外从状层(outer plexiform layer, OPL)比内从状层偏薄；外核层(outer nuclear layer, ONL)由多层细胞排列组成,染色深排列紧密；光感受器细胞层(photoreceptor cell layer,PRL)内外节形态规整。B组、E组大鼠视网膜各层细胞结构排列紊乱,节细胞等各层细胞数减少,内界膜不完整,视网膜血管内皮细胞增殖,新生血管芽呈垂直状突破内界膜生长,出现早期新生血管(neovascularization, NV)表现。C组、D组各层细胞结构排列较紊乱,各层细胞数目相对较少,可见内界膜局部不完整。5.免疫组织化学染色：A组：NGF表达呈阳性,阳性细胞边界较清晰,主要位于视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells, RGCs)层, IPL、OPL、外界膜、色素上皮层,INL和ONL仅有少量表达。B、E组：2W时NGF表达呈阳性,各层表达量增加,阳性着色较深。4W时NGF阳性表达开始减弱,各层表达量减少。8W时NGF阳性表达显著减少,各层阳性染色均较浅。C、D组：2W时NGF表达增多,随着时间的推移,NGF阳性表达逐渐增强,8W时达到高峰,C组更为明显,染色更深。6. RT-PCR检测视网膜NGF mRNA的相对表达量：2w时4个DR组间视网膜NGF mRNA表达差异无显著性(F=0.163,P=0.920),其他时间点相比差异均具有显著性(F=13.737,25.060,123.277, P均为0.000)。4w、6w、8w时B组与E组NGF mRAN相比差异无显著性(P=0.703,P=0.801,P=0.819),与C组、D组相比差异具有显著性(P<0.05)。4w、6w时C组、D组相比差异无显著性(P=0.542,0.801),8w时C组与D组相比差异有显著性(P<0.05)。结论1.STZ诱导的DM大鼠,是模拟糖尿病视网膜病变的一种可靠的动物模型；2.DR早期即会对视网膜各层细胞造成损伤；3.DR早期引起NGF的表达升高,随着时间的推移NGF表达呈下降趋势,视网膜神经功能减退；4.玻璃体腔注射hUCMSCs可改善DR视网膜功能,增加NGF的表达,改善视网膜功能；5.高浓度hUCMSCs对DR的保护效果要优于低浓度hUCMSCs的效果。

糖尿病大鼠玻璃体腔移植不同浓度人脐带间充干细胞的实验研究

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