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全氟异丁烯急性吸入性肺损伤的病理机制研究

作　者: 王延琳
导　师: 丁日高; 王和枚
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 公共卫生与预防医学
关键词: 急性肺损伤全氟异丁烯血管紧张素Ⅱ 肺毛细血管内皮细胞
分类号: R563.8
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

作为重要的化工原料和副产物，全氟异丁烯（perfluoroisobutylene，PFIB）是一种常温下为气态的无色无味低分子量的高氟有机物，能穿透普通防毒面具，且无特效的防治措施，是常见的可引起急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征（acutelung injury，ALI/acute respiratory distress syndrome，ARDS）的有毒化学品。目前，对PFIB所致ALI的发病机制研究认为直接氧化损伤可能是PFIB致病的重要机制之一；同时，多形核白细胞（polymorphonuclear leukocyte，PMN）介导的过度炎症反应可能是PFIB致病的另一重要机制。同时，肺泡巨噬细胞（alveolar macrophage，AM）参与PMN介导的PFIB急性吸入性肺损伤，并与PMN在肺内的扣押有关。PFIB急性吸入后可激活肺组织内多种细胞，尤其是间接激活AM内核因子κ B （nuclear factor-ha，NF-κ B），进而诱导AM表达多种致炎因子，这些致炎因子对PMN具有强烈的激活和趋化活性，但有关PFIB通过何种机制激活NF-κ B仍不清楚，PFIB急性吸入性肺损伤的机制研究仍有待完善。一、内源性血管紧张素II在PFIB急性吸入性肺损伤中的作用近年研究发现，肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin system，RAS）在ALI/ARDS的发生、发展中发挥重要作用。血管紧张素II（angiotensin Ⅱ，AngⅡ）作为RAS的主要效应物质不仅是重要的体液调节因子参与调节血液循环，而且还是重要的前炎症因子，可上调NF-κB活性，增加白介素-8（Interleukin-8，IL-8）、白介素-1β（Interleukin-1beta，IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosisfactor-α，TNF-α）等炎症因子的表达释放，引发炎症反应。而血管紧张素转换酶（angiotensin convert enzyme，ACE）/血管紧张素转换酶2（angiotensin convertenzyme2，ACE2）分别作为AngⅡ的正/负性调节酶影响ALI的进程。减少AngⅡ的生成或阻断AngⅡ受体均可减轻多种原因所致的肺损伤。AngⅡ在PFIB急性吸入性肺损伤中的作用如何，它是否作为PFIB急性吸入性肺损伤的始动因素激活NF-κ B进而介导PFIB急性吸入性肺损伤，目前尚未见文献报道。本文的研究目的之一即是对上述问题进行初步探讨。1、观察PFIB吸入染毒后，大鼠肺组织AngⅡ含量及其调节酶ACE的蛋白表达水平、酶活性与肺损伤程度的时间变化关系：大鼠PFIB急性吸入染毒后，肺系数、支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）总蛋白含量和肺组织病理学检查等指标均显示肺损伤程度逐渐加重，至染毒后16h达峰值，染毒后24h明显缓解，因此确定本实验成功复制了大鼠PFIB急性吸入染毒病理模型。在此基础上，采用放射免疫分析方法检测PFIB染毒后大鼠的血液和肺组织匀浆中AngⅡ含量随时间的变化：血浆和肺组织中AngⅡ含量均呈现先升高后降低的变化趋势，其中肺组织AngⅡ含量在染毒后16h、24h较空白对照组显著降低。血浆AngⅡ含量与肺组织中AngⅡ变化趋势基本一致，但各时间点均无统计学差异；采用紫外线吸收法检测肺组织ACE酶活性随时间的变化：PFIB染毒后肺组织ACE活性在一定范围内波动，但各时间点无统计学差异。分析结果，肺组织AngⅡ含量和ACE酶活性的变化与肺损伤程度无明显的时间关联性，提示AngⅡ在大鼠PFIB急性吸入性肺损伤的发生、发展中可能不具有重要的病理学意义。2、针对RAS发挥病理生理作用的最关键成分AngⅡ，选择AngⅡ的AngⅡ1型受体（angiotensionⅡ type1receptor，AT1-R）阻断剂氯沙坦，从时间-效应和剂量-效应两个方面考察AngⅡ在大鼠PFIB急性肺损伤中的作用：①时间-效应关系，PFIB染毒对照组大鼠的各项肺系数和BALF总蛋白含量较溶剂对照组显著升高，说明染毒模型建立成功。但不同时间给予氯沙坦（分别在PFIB染毒前1h、染毒前0.5h、染毒后0.5h、染毒后1h、染毒后2h、染毒后4h和染毒后8h腹腔注射氯沙坦10mg/kg）阻断AngⅡ受体进行预防或治疗，各组大鼠肺系数和BALF总蛋白含量与染毒对照组比较没有显著性差异。②剂量-效应关系，PFIB染毒对照组大鼠的各项肺系数和BALF总蛋白含量显著高于溶剂对照组，说明染毒模型建立成功。但给予不同剂量氯沙坦（分别在PFIB染毒前1h腹腔注射氯沙坦1.25、2.5、5、10和15mg/kg）阻断AngⅡ受体进行预防，各组大鼠肺系数和BALF总蛋白含量与染毒对照组比较没有显著性差异。以上结果表明，不同给药时间和不同给药剂量给予氯沙坦阻断AT1-R对PFIB急性肺损伤的影响微弱，进一步提示AngⅡ在PFIB急性吸入性肺损伤中可能不具有重要意义。3、比较两种来源不同的AngⅡ受体阻断剂对PFIB急性吸入性肺损伤的防治效果：采用大样本量的小鼠为实验对象，观察国产和进口两种不同来源的氯沙坦对小鼠全身暴露吸入PFIB染毒后24h肺系数和72h死亡率的影响，实验结果表明染毒对照组和各个时间给药组（染毒前0.5h、染毒后0.5h和染毒后1h给药40mg/kg）比较均无显著性差异。这说明国产和进口来源的氯沙坦对小鼠PFIB急性吸入性肺损伤均无明显的防治作用。结果提示，AngⅡ在PFIB急性吸入性肺损伤中病理学意义有限。综合分析，大鼠PFIB急性吸入性肺损伤过程中肺组织AngⅡ及其调节酶ACE与肺损伤程度无明显的时间相关性。时间-效应和剂量-效应关系研究揭示AT1-R阻断剂氯沙坦对大鼠PFIB急性肺损伤无明显影响。选择多个时间点腹腔注射两种不同来源的氯沙坦对小鼠PFIB急性吸入性肺损伤均无明显的改善作用。结果表明，AngⅡ在PFIB急性吸入性肺损伤中的病理作用微弱，RAS在PFIB急性肺损伤的发生、发展过程中可能不发挥主要作用，PFIB通过AngⅡ激活NF-κB启动炎症级联的通路可能并不存在。以上结果可能与不同ALI模型对RAS的影响不同有关，也可能与RAS复杂的生物学作用有关，其具体机理有待进一步研究。二、PFIB对PMVEC功能的影响肺气血屏障（blood-gas barrier）的结构和功能受损在各种原因所致ALI中居中心地位。其中，肺毛细血管内皮细胞（pulmonary microvascular endothelialcell，PMVEC）作为各种致病因素作用的靶细胞首先受到攻击，也是PMN扣押和游出血管时首先接触的细胞，所以PMVEC在ALI时的结构和功能变化受到越来越多的学者关注。研究表明，肺损伤时气血屏障的细胞连接破坏、细胞骨架重排是炎性细胞渗出的关键环节，结果导致液体、蛋白、炎性介质等进入肺泡，这些构成了ALI的主要病理基础。PFIB染毒除了引起肺气血屏障主要细胞的结构发生病理改变，还影响细胞的分泌功能。一般情况下，血管内皮细胞受到炎症刺激时其胞内转录因子NF-κB被激活，促使多种炎性介质mRNA表达，进而诱发合成并释放肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），同时诱导细胞间粘附分子-1（intercellular adhension molecular-1，ICAM-1）、血管细胞粘附分子-1（vascular celladhesion molecule-1，VCAM-1）、E-选择素等粘附分子的表达，促进PMN趋化和聚集，分泌基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）如基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）、基质金属蛋白酶-9（matrixmetalloproteinase-9，MMP-9）等降解基底膜、破坏正常肺泡结构，并引发更多的炎性细胞聚集和活化。本课题的研究目的是，拟在前期PFIB染毒对肺气血屏障形态学研究的基础上，观察体外培养的PMVEC经PFIB染毒后分泌功能的变化特点，重点观察细胞因子（TNF-α、IL-1β）、粘附分子（ICAM-1）和基质金属蛋白酶（MMP-2、MMP-9）的表达情况，探讨PMVEC在PFIB急性吸入性肺损伤过程中形态结构改变与功能变化的关联性，以丰富对PFIB染毒后气血屏障结构和功能的变化规律及PFIB急性吸入性肺损伤发病机制的认识，为更有效和针对性地防治PFIB急性吸入性肺损伤提供重要依据。实验结果如下：①PFIB刺激PMVEC染毒后0.5h即迅速合成大量TNF-α，至2h达峰值。PMVEC合成大量TNF-α的同时缓慢释放到细胞外，至染毒后4h培养上清液中TNF-α含量才达峰值。②PFIB染毒后2h内刺激PMVEC合成大量的IL-1β，至2h达峰值，2h后伴随着PMVEC细胞凋亡数的增多合成的IL-1β也慢慢减少，但合成的IL-1β始终未释放到细胞外。③PFIB染毒后迅速促进PMVEC大量合成ICAM-1，但始终未有ICAM-1大量释放到细胞外。④染毒后PMVEC的培养上清液中MMP-2含量渐升高，至染毒后2h显著性增高，然后渐降低。PFIB染毒刺激PMVEC培养上清液中MMP-2迅速表达生物学活性。⑤PFIB染毒并未刺激PMVEC生成和释放大量MMP-9，提示PFIB急性吸入性肺损伤时PMVEC可能不是MMP-9的主要来源。综合前期研究结果分析，一方面PFIB染毒促进PMVEC大量凋亡，使肺气血屏障的完整性遭到破坏；另一方面刺激存活的PMVEC合成并释放大量TNF-α，表达ICAM-1。在上述因子与其它因素的综合作用下，PMN激活并粘附于PMVEC，释放活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）与蛋白酶类，对PMVEC及其基底膜造成进一步损伤。此外，PFIB染毒刺激PMVEC迅速释放大量MMP-2，后者可加速肺泡微血管内皮细胞连接的破坏、细胞骨架的重排，并破坏细胞外基质。以上因素综合作用的结果是肺气血屏障完整性受到破坏，失去对大分子的屏障作用，血浆蛋白漏出形成渗透梯度，血浆水分也随之进入血管外造成水肿，炎症介质等进入肺泡内，这些也是ALI主要的病理基础。

全文目录

英文缩略词表  5-8
中文摘要  8-12
ABSTRACT  12-17
前言  17-22
第一章内源性血管紧张素 II 在 PFIB 急性吸入性肺损伤中的作用研究  22-47
  引言  22
  第一节大鼠 PFIB 急性吸入性肺损伤时 AngⅡ及相关酶类的变化规律  22-35
    1. 材料与方法  22-29
    2. 结果  29-33
    3. 讨论  33-35
  第二节 AngⅡ1 型受体阻断剂对大鼠 PFIB 急性吸入性肺损伤的影响  35-42
    1. 材料与方法  35-37
    2. 结果  37-40
    3. 讨论  40-42
  第三节两种 AngII1 型受体阻断剂对小鼠 PFIB 急性吸入性肺损伤的影响  42-47
    1. 材料与方法  42-44
    2. 结果  44-45
    3.讨论  45-47
第二章 PFIB 对 PMVEC 功能的影响  47-74
  引言  47
  第一节 PFIB 染毒对 PMVEC 表达 ICAM-1、TNF- α和 IL-1β等的影响  47-65
    1. 材料与方法  47-55
    2. 结果  55-62
    3. 讨论  62-65
  第二节 PFIB 染毒对 PMVEC 表达 MMP-2、MMP-9 蛋白含量和活力的影响  65-74
    1. 材料与方法  65-71
    2. 结果  71-72
    3. 讨论  72-74
总讨论  74-76
参考文献  76-83
综述  83-91
  参考文献  87-91
在学期间发表论文  91
附件  91-111
  血管紧张素Ⅱ在大鼠全氟异丁烯急性吸入性肺损伤中的作用初探  91-102
  氯沙坦对大鼠全氟异丁烯急性肺损伤的防治作用研究  102-111
个人简历  111-112
致谢  112

全氟异丁烯急性吸入性肺损伤的病理机制研究

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