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经鼻腔给予oxLDL诱导免疫耐受在ApoE~(-/-)小鼠动脉粥样硬化发病中作用机制研究

作　者: 钟禹成
导　师: 曾秋棠; 王祥
学　校: 华中科技大学
专　业: 心血管内科
关键词: 氧化低密度脂蛋白 ApoE-/-小鼠 免疫耐受 动脉粥样硬化 免疫系统 调节性T细胞
分类号: R543.5
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


第一部分经鼻腔给予oxLDL诱导ApoE-/-小鼠免疫耐受模型的建立及评价目的：应用经鼻腔给予氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein, oxLDL)法建立ApoE-/-小鼠免疫耐受模型。方法：设立试验组、免疫对照组和空白对照组,前两组分别经鼻腔给予oxLDL和同等体积PBS,每日1次,连续5次。末次给予oxLDL后的第3天用100μg oxLDL进行免疫,免疫二周后摘眼球处死小鼠。应用3H-胸腺嘧啶核甘(3H-TdR)渗入法检测小鼠oxLDL特异性脾淋巴细胞增殖反应,应用ELISA法和Real-Time RT-PCR检测细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-17及TGF-β含量和mRNA表达水平,应用ELISA法检测小鼠血清抗oxLDL抗体水平,应用流式细胞术检测CD4+CD25+调节性T细胞(Tregs)亚群的变化。结果：oxLDL刺激后试验组小鼠脾淋巴细胞增殖效果明显低于对照组(p<0.05)；试验组脾淋巴细胞分泌TGF-β量及TGF-βmRNA表达水平显著高于对照组(p<0.05),同时其IFN-γ、IL-4和IL-17 mRNA表达水平较对照组明显降低,但三组小鼠脾淋巴细胞的IL-10 mRNA表达水平没有显著不同(p>0.05)；试验组小鼠CD4+CD25+Tregs占CD4+T细胞比例显著高于对照组(p<0.05)；另外,与对照组相比,试验组小鼠血清抗oxLDL抗体水平显著降低(p<0.05)。结论：经鼻腔多次给予小剂量oxLDL可以成功建立ApoE-/-小鼠免疫耐受模型。第二部分经鼻腔给予oxLDL诱导CD4+LAP+和CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞抑制效应性T细胞免疫反应及延缓ApoF-/-小鼠动脉粥样硬化发生发展目的：大量研究已证实,动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是一种慢性免疫炎症性疾病,氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein, oxLDL)特异性T细胞可促进动脉粥样硬化病变进程中炎症免疫反应。经口腔多次给予小剂量oxLDL不仅诱导免疫耐受,同时可显著抑制AS发生发展。然而,粘膜免疫耐受的确切机制目前仍不清楚,特别是经鼻腔诱导免疫耐受。本研究通过经鼻腔多次给予小剂量oxLDL对AS发生发展的影响,从而进一步阐明粘膜免疫耐受在AS中作用机制。方法及结果：6和16周龄的雄性ApoE/-/-小鼠经鼻腔给予3μg oxLDL,每日一次,连续五天,高脂喂养诱导动脉粥样硬化形成。经鼻腔给予同等体积的PBS液作为对照组。16及24周龄时,摘眼球处死小鼠,油红O和HE染色评估动脉粥样硬化斑块面积。流式细胞仪检测oxLDL免疫耐受后4和14天小鼠颈淋巴结和脾脏内CD4+LAP+和CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(regulatory T cells, Tregs)和效应性T细胞(Th-1、-2、-17)的变化；ELISA和Real-Time RT-PCR法检测小鼠脾淋巴细胞分泌细胞因子(如：IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-17和TGF-β)水平和细胞因子mRNA表达水平；Real-Time RT-PCR法检测动脉粥样硬化斑块内调节性T细胞和炎症细胞标志物的mRNA表达水平。结果显示,经鼻腔给予oxLDL诱导免疫耐受显著抑制动脉粥样硬化的起始(47.6%,p<0.001)和进展(21.1%,p=0.001)；特别是oxLDL强化免疫耐受能进一步抑制动脉粥样硬化病变进展(35.8%,p<0.001)。同时,经鼻腔给予oxLDL显著增加小鼠脾脏和颈淋巴结内CD4+LAP+和CD4+CD25+Foxp3+Tregs占CD4+T细胞百分比,同时抑制效应性T细胞(如Th1、Th2和Th17)免疫应答。结论：经鼻腔多次给予小剂量oxLDL有效抑制AS的发生发展,抵抗oxLDL免疫耐受小鼠体内TGF-β可显著增加AS斑块面积,其可能机制为小鼠体内CD4+LAP+和CD4+CD25+Foxp3+Tregs数量显著增加及分泌高水平抗炎细胞因子TGF-β;因此,认为经鼻腔给予oxLDL诱导免疫耐受有望成为防治AS发生发展的新方法。

全文目录


中文摘要  6-8
Abstracts  8-12
前言  12-18
  参考文献  15-18
第一部分 经鼻腔给予OXLDL诱导APOE~(-/-)小鼠免疫耐受模型的建立及评价  18-41
  材料及方法  19-30
  结果  30-31
  讨论  31-33
  参考文献  33-37
  附图  37-41
第二部分 经鼻腔给予OXLDL诱导CD4~+LAP~+和CD4~+CD25~+FOXP3~+调节性T细胞抑制效应性T细胞免疫反应及延缓APOE~(-/-)小鼠动脉粥样硬化发生发展  41-85
  材料及方法  43-59
  结果  59-64
  讨论  64-67
  参考文献  67-72
  附表  72-73
  附图  73-85
总论与创新  85-86
综述 调节性T细胞、免疫耐受与动脉粥样硬化  86-103
  参考文献  93-103
附录一 英文缩略词表及中文对照  103-105
附录二 攻读博士学位期间主要发表的论文  105-106
致谢  106-107

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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 心脏、血管（循环系）疾病 > 血管疾病 > 动脉疾病
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