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白念珠菌Sap2快速检测方法的建立

作　者: 仇萌
导　师: 邹先彪
学　校:
专　业: 皮肤病与性病学
关键词: 白念珠菌分泌型天冬氨酸蛋白酶多克隆抗体乳胶凝集实验
分类号: R756
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

研究背景：白念珠菌是常见的条件致病性真菌，可引起浅表的皮肤、粘膜损害，也可侵入深部器官引起侵袭性感染。近年来，侵袭性念珠菌病发病率及病死率显著增加，其中白念珠菌感染最为常见，但由于侵袭性白念珠菌感染临床表现缺乏特异性，早期诊断困难导致许多患者得不到及时救治而致病程迁延或死亡，因此建立一种快速准确的白念珠菌检测方法对于挽救患者的生命具有重大意义。分泌性天冬氨酸蛋白酶2是白念珠菌分泌产生的一种胞外水解酶，是白念珠菌致病的重要毒力因子，能降解细胞外基质、角蛋白、粘蛋白及免疫球蛋白等多种蛋白，为白念珠菌提供营养，并促进白念珠菌黏附上皮细胞，侵入宿主造成组织损伤及协助其逃逸宿主防御系统的破坏。当患者系统性感染白念珠菌时，Sap2以可溶性抗原形式存在于血清中。本研究通过建立乳胶凝集试验来检测侵袭性白念珠菌感染小鼠血清内的Sap2抗原，为Sap2抗原检测对侵袭性白念珠菌感染的早期诊断提供依据。研究内容和目的：构建Sap2重组原核表达载体并表达、纯化出可溶性的蛋白作为抗原；制备多克隆抗体，验证抗体的特异性；建立乳胶凝集法测定侵袭性白念珠菌感染的小鼠血清中Sap2抗原，探讨其对侵袭性白念珠菌感染的诊断价值，同时为进一步制备白念珠菌快速鉴定试剂盒奠定基础。研究方法：1、玻璃珠法提取白念珠菌基因组DNA为模板，根据SAP2全序列和和原核表达载体pMAL-c2x（+）序列的酶切位点设计引物，经PCR方法获取SAP2目的基因。双酶切SAP2基因与原核表达载体pMAL-c2x（+），连接酶切产物，转化大肠杆菌TOP10感受态细菌，筛选菌落和测序鉴定。2、将pMAL-c2x/SAP2重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，在16℃经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷酶（IPTG）诱导表达出可溶性的融合蛋白，经直链淀粉树脂亲和层析、蛋白酶Factor Xa切割标签获得纯化的Sap2蛋白。3、用可溶性Sap2免疫9只BALB/c小鼠，使其产生致敏B淋巴细胞。初次免疫后分别在第14天、21天、28天加强免疫，共4次，免疫第4次后10天收集尾静脉小量收集小鼠血清，用间接ELISA法检测抗血清效价。待确定高效价抗血清产生后，低温离心大量收集血液。用ProteinG亲和层析柱纯化抗血清，通过SDS-PAGE电泳检测抗体纯度，并利用Western blot检测抗体特异性。4、通过化学交联法用抗Sap2多克隆抗体致敏聚苯乙烯乳胶，并进行偶联条件优化，同时建立侵袭性白念珠菌感染小鼠模型，在白念珠菌攻击小鼠后的第12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h、120h取血，分离血清后与致敏胶乳反应，进行结果判定，并与血培养结果比较。研究结果：1.经PCR扩增获得的目的基因分子量与预计相同,并定向插入原核表达载体pMAL-c2x（+）中，双酶切后电泳获得预期的SAP2条带，经测序证实为正确的SAP2序列，阅读框架正确，可以进行目的蛋白的诱导表达。2．重组原核表达载体pMAL-c2x/SAP2经IPTG诱导14h后表达出可溶性的融合蛋白，并经纯化、切除标签后得到32mg目的蛋白。3、成功制备了抗Sap2多克隆抗体，抗体效价大于1:51200，经过亲和层析法纯化后，Western blot检测结果表明其特异性高。4、偶联条件优化后证实当温度为37℃时，在加入150mg抗体与乳胶偶联4h后偶联效率最高，且致敏乳胶无自凝性，可重复性好。成功建立侵袭性白念珠菌感染的小鼠模型，在白念珠菌接种后12h乳胶凝集法即可检出Sap2抗原。乳胶凝集法检测抗原的阳性率为96.7%，血培养阳性率为90%，两者差异无统计学意义（χ2=0.25，P>0.05）。乳胶凝集法诊断侵袭性白念珠菌感染的特异性为91.2%，敏感性为96.1%。研究结论:1.克隆出SAP2基因，成功构建了pMAL-c2x/SAP2原核表达载体。2.经IPTG低温诱导可以表达出可溶性的MBP-Sap2融合蛋白，通过亲和层析及标签切除成功获得Sap2目的蛋白。3、rSap2通过动物免疫可以制备多克隆抗体，纯化后抗体特异性高。4、乳胶凝集试验在机体感染白念珠菌12h后即可检测到Sap2，且操作简便快速，特异性和敏感性高，可以为侵袭性白念珠菌感染的早期阶段提供有价值的诊断依据。

全文目录

英文缩略词表  6-8
中文摘要  8-11
Abstract  11-15
前言  15-19
第一部分 Sap2 重组原核表达载体的构建、蛋白表达及纯化  19-45
  1.实验材料  19-24
    1.1 试验菌株  19
    1.2 主要试剂  19-20
    1.3 主要仪器  20-21
    1.4 主要液体配制  21-24
  2.方法  24-32
    2.1 基因克隆  24-30
    2.2 Sap2 基因原核表达  30-31
    2.3 蛋白纯化  31-32
  3.实验结果  32-36
    3.1 PCR 结果  32-33
    3.2 重组载体的酶切鉴定结果  33
    3.3 测序结果  33-35
    3.4 重组载体 pMAL-c2x/ SAP2 的可溶性表达  35-36
    3.5 目的蛋白的纯化  36
  4.讨论  36-40
  结论  40-41
  参考文献  41-45
第二部分抗 Sap2 多克隆抗体的制备、纯化及特异性鉴定  45-57
  1.实验材料  45-47
    1.1 实验动物  45
    1.2 主要试剂及液体配制  45-46
    1.3 主要仪器设备  46-47
  2.方法  47-49
    2.1 鼠抗血清制备  47-48
    2.2 抗血清的纯化  48
    2.3 鼠抗 rSap2 多克隆抗体的特异性鉴定  48-49
  3.结果  49-51
    3.1 抗血清的效价检测  49-50
    3.2 抗血清的纯化  50
    3.3 Western Blot 分析多克隆抗体的特异性  50-51
  4.讨论  51-54
  结论  54-55
  参考文献  55-57
第三部分 Sap2 抗原乳胶凝集检测方法的建立  57-77
  1.实验材料  57
    1.1 实验动物  57
    1.2 主要试剂  57
    1.3 主要仪器  57
  2.方法  57-61
    2.1 抗 Sap2 多克隆抗体致敏乳胶及偶联条件优化  57-59
    2.2 侵袭性白念珠菌感染动物模型的建立  59-61
    2.3 致敏乳胶试剂与小鼠血清反应  61
  3.结果  61-68
    3.1 偶联条件优化结果  61-62
    3.2 致敏乳胶的质量评估结果  62-63
    3.3 致敏乳胶试剂与小鼠血清中反应结果  63-68
  4.讨论  68-73
  结论  73-74
  参考文献  74-77
文献综述  77-84
  参考文献  80-84
攻读学位期间发表文章情况  84-85
致谢  85-86

白念珠菌Sap2快速检测方法的建立

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