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鼠疫菌蛋白YpkA和人蛋白VASP的相互作用和功能研究

作　者: 柯跃华
导　师: 杨瑞馥; 杜宗敏
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 军事预防医学
关键词: YpkA VASP 蛋白-蛋白相互作用 磷酸化 报告基因活性分析
分类号: R378
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


鼠疫的病原是鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis,简称鼠疫菌),分类上属于肠杆菌科耶尔森氏菌属。鼠疫菌是一种革兰氏阴性兼性胞内致病菌,一般通过染疫的蚤类叮咬在宿主动物间传播,偶尔通过接触染疫的动物皮毛、染疫的蚤类叮咬传播到人类。鼠疫菌拥有一个被称为III型分泌系统(Type III Secretion System,T3SS)的蛋白输送装置,它在抗吞噬、抑制细胞因子产生、促进宿主细胞凋亡等方面都发挥着极其重要的作用。通过它鼠疫菌将6个效应蛋白--YopH、YopE、YopT、YopM、YopJ/P和YpkA/YopO注射进入宿主细胞内,这些效应蛋白利用自身的生化活性所作用于不同的靶标,促进细菌感染的进行。其中一个效应蛋白YpkA(在小肠结肠炎耶尔森氏菌中称为YopO)是在原核生物中发现的第一个含有丝氨酸/苏氨酸激酶结构域的蛋白,由732aa组成,分子量为82KD,用有多个结构域。YpkA部分定位于细胞膜,能够引起细胞变圆,但是细胞并不脱落。YpkA的GDI结构域与宿主细胞RhoGDI在分子结构上非常相似,这使得YpkA能够模拟宿主的RhoGDI分子的功能,与RhoA/Rac1结合并导致它们的失活,从而破坏细胞骨架。尽管对YpkA已经有了一些研究,但是相对于YpkA复杂的结构和多样的功能,人们对其作用于细胞的分子机制仍然知之甚少。我们采用酵母双杂交的方法,以YpkA作为诱饵蛋白筛选人脾脏cDNA文库,获得了3个均指向VASP的阳性克隆,这说明YpkA很有可能与VASP相互作用。VASP(Vasodilator-Stimulated Phosphoprotein)属于Ena/VASP蛋白家族,是一种细胞骨架调节蛋白,在维持细胞形态和调节细胞运动中起重要作用。它能够直接促进肌动蛋白丝的组装,调节细胞层状伪足和片状伪足形成,从而起到影响细胞运动的作用。VASP的功能受到蛋白激酶的调节,它有三个磷酸化位点,即Ser157、Ser239和Thr278。这三个位点分别能够被PKA、PKG和AMPK特异性的磷酸化,VASP的磷酸化影响了它与其它蛋白的直接相互作用,进而影响了它自身及下游蛋白的功能,从而使它对肌动蛋白组装、应力纤维形成和细胞吞噬等过程的调节作用受到影响。可以看出,不论是从蛋白定位、生化基础,还从已知的功能来看,YpkA都存在着与VASP相互作用的基础。于是我们采用GST-Pull Down、免疫共沉淀和荧光共定位等技术在体内、体外验证YpkA与VASP的相互作用,确认YpkA和VASP的相互作用不是物理性的,而是功能性的。然后研究YpkA对VASP磷酸化的影响,采用定点突变技术研究对VASP的磷酸化是否具有位点特异性或优先性,以及这种磷酸化在VASP发挥功能中的作用。最后,采用报告基因、免疫荧光和RNAi等技术研究YpkA和VASP的相互作用对细胞F-actin组装、应力纤维形成和吞噬能力的影响。通过实验我们可以得出以下结论:鼠疫菌通过分泌的YpkA作用于VASP,促进VASP的磷酸化,抑制细胞内的肌动蛋白组装,破坏细胞应力纤维的形成,从而抑制细胞的吞噬功能,促进鼠疫菌在胞外的生存。这说明鼠疫菌在长期进化过程中具备了精巧的分子机制,以促进对机体的感染和致病。本研究揭示了耶尔森氏菌重要毒力因子YpkA在耶尔森氏菌和宿主细胞相互作用中所扮演的角色,促进对耶尔森氏菌致病机理的理解,为我们深入理解鼠疫菌致病机理提供了一个新角度,也为我们预防和治疗鼠疫提供了一个新的分子靶标。另外,本实验室使用酵母双杂交的方法对鼠疫菌蛋白和人蛋白之间相互作用进行了筛选。采用154个鼠疫菌毒力相关基因筛选了人脾脏cDNA文库,共获得了67个鼠疫菌蛋白和109个人蛋白之间的208对相互作用,根据这208对相互作用我们构建了一个鼠疫菌蛋白和人蛋白之间的相互作用网络。酵母双杂交作为目前大规模筛选蛋白-蛋白相互作用最可靠工具之一,已经被全世界的科学家广泛地用于筛选物种内部或物种之间的蛋白-蛋白相互作用,但是由于酵母双杂交技术本身存在的缺陷,很容易出现假阳性或加阴性。为了克服假阳性问题,我们采用GST Pull down的方法进行验证,总共验证了42对相互作用,其中37对阳性。由于发现多个鼠疫菌基因与NF-κB信号通路和MAPK信号通路分子存在相互作用,而NF-κB和MAPK报告基因活性检测起来又比较方便,我们又采用检测报告基因的方法验证这些鼠疫菌基因和免疫信号通路之间的相互作用。采用GST Pull down方法和报告基因检测这两种方法,对酵母双杂交获得的数据进行了蛋白-蛋白相互作用的物理性和功能性验证。根据这些对相互作用的验证,我们认为酵母双杂交得到的蛋白-蛋白相互作用数据还是可信度比较高的,可以对我们构建的网络进行下一步分析。分析鼠疫菌蛋白和人蛋白相互作用网络有助于我们深入理解鼠疫菌的致病机理和人体抗感染反应特征,为寻找针对鼠疫更好的疫苗和治疗靶标打下基础。

全文目录


中文摘要  7-9
英文摘要  9-11
缩略语  11-12
第一章 前言  12-30
  1 鼠疫菌及其致病机制  12-15
    1.1 鼠疫的危害  12-13
    1.2 鼠疫的病原学与致病机制  13-14
    1.3 鼠疫菌III 型分泌系统  14-15
  2 细菌与宿主的相互作用  15-21
    2.1 病原菌侵入宿主细胞的机制  15-17
    2.2 病原菌的抗吞噬机制  17-18
    2.3 病原菌调节宿主细胞骨架促进其感染  18-21
  3 病原与宿主蛋白相互作用网络  21-26
    3.1 研究蛋白-蛋白相互作用的常用技术  21-22
    3.2 蛋白相互作用网络的研究现状  22-24
    3.3 病毒与宿主蛋白相互作用  24-25
    3.4 细菌与宿主蛋白相互作用  25-26
  4 本研究的目的与主要内容  26
  参考文献  26-30
第二章 疫菌蛋白YpkA 和人蛋白VASP 的相互作用及功能研究  30-84
  1 材料  33-36
  2 试验方法  36-49
  3 实验结果  49-72
    3.1 酵母双杂交获得YpkA 和VASP 的相互作用  49-50
    3.2 YpkA 和VASP 原核、真核表达载体的构建  50
    3.3 YpkA 和VASP 相互作用的验证  50-54
    3.4 YpkA 抑制VASP 对体外肌动蛋白组装的活化  54-56
    3.5 YpkA 与VASP 相互作用的结构域  56-58
    3.6 YpkA 对VASP 的磷酸化作用  58-60
    3.7 YpkA 与VASP 的相互作用对细胞内肌动蛋白组装的影响  60-66
    3.8 YpkA 与VASP 的相互作用对细胞肌动蛋白应力纤维形成的影响  66-70
    3.9 YpkA 与VASP 的相互作用对细胞吞噬功能的影响  70-72
  4 讨论  72-79
    4.1 YpkA 是一个重要的鼠疫菌抗吞噬因子  72-73
    4.2 VASP 的生理功能：通过调节肌动蛋白的组装来保护内皮细胞完整性和抑制血小板凝集  73-75
    4.3 鼠疫菌通过YpkA 作用于VASP 导致机体出血和水肿  75-76
    4.4 多种病原体以VASP 为细胞内攻击的靶标分子  76-78
    4.5 结论  78-79
  参考文献  79-84
第三章 疫菌蛋白和人蛋白相互作用的验证  84-102
  1 材料  86-87
  2 实验方法  87-88
  3 实验结果  88-98
    3.1 鼠疫菌基因原核表达载体的构建  88-90
    3.2 人基因真核表达载体的构建  90-91
    3.3 鼠疫菌蛋白和人蛋白相互作用的验证  91-92
    3.4 鼠疫菌基因对NF-κB 信号通路的影响  92-95
    3.5 鼠疫菌基因对 MAPK 信号通路的影响  95-98
  4 讨论  98-100
  参考文献  100-102
文献综述  102-116
  参考文献  110-116
博士期间已发表和待发表的文章  116-118
论文发表情况  118-132
个人简介  132-134
致谢  134-135

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学微生物学（病原细菌学、病原微生物学） > 病原细菌
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