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柑橘类黄酮的分离、结构鉴定、化学修饰及生物活性研究

作　者: 单杨
导　师: 李忠海
学　校: 中南林业科技大学
专　业: 林产化学加工工程
关键词: 柑橘皮 类黄酮 超声波辅助提取 结构鉴定 抗氧化 活性筛选 化学修饰
分类号: R284
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


柑橘是我国的大宗水果,皮中富含精油、果胶和类黄酮等生物活性成分,是一种具有很高开发潜力的资源。但目前我国柑橘加工业的副产物——柑橘皮渣基本没有利用,造成优质资源的浪费。本研究旨在开展温州蜜桔皮的基本组成分析,探讨柑橘皮中类黄酮化合物的提取工艺和分离纯化方法,对纯化的类黄酮化合物进行结构鉴定和化学修饰改性。同时,通过系列体外抗氧化能力和活性筛选模型进行柑橘类黄酮化合物的生物活性研究,为柑橘皮类黄酮的综合利用提供理论依据,主要研究内容和结果如下：应用氨基酸全自动分析技术对温州蜜桔皮中蛋白质的分析,结果表明柑橘皮中蛋白质百分含量为3.45%(干物质),其中必须氨基酸含量占1.34%,蛋白质中必须氨基酸占35.96%,略小于大豆分离蛋白中必须氨基酸的39.4%。蛋氨酸和胱氨酸为柑橘皮中的限制性氨基酸。采用GC-MS技术对柑橘皮油中的脂肪酸和挥发油的化学组成进行分析鉴定,确定柑橘皮油主要含有13种脂肪酸：6种饱和脂肪酸,占脂肪酸总量的27%,主要是十六烷酸19.75%；7种不饱和脂肪酸,占脂肪酸总量的66.62%,主要是9,12-十八碳二烯酸37.14%、亚麻酸19.06%。温州蜜桔精油中挥发性成分基本由烃类化合物组成,占总量的96.56%,其它含量由高到底依次为醇类、醛类、酮类、酯类和酚类化合物。其中烃类化合物以烯烃类不饱和化合物(84.85%)为主,主要是异柠檬油精(25.92%)、2-(1-甲基乙缩醛)-二环[2,2]庚烷(19.82%)、4-甲基-1-(1-甲乙基)-环己烯(15.81%),炔烃化合物以2-乙基-1-辛烯-3-炔(9.20%)为主。醇类、醛类、酮类、酯类和酚类化合物含量相对很少。应用高压液相色谱及紫外光谱技术,对柑橘皮中类黄酮的种类进行了分析,初步确定柑橘皮中类黄酮种类应有25种左右。采用二次通用旋转组合设计研究了柑桔皮中总黄酮的超声波辅助提取工艺,并对建立的数学模型进行了规划求解及试验验证。结果表明：pH值对总黄酮得率有极显著影响,乙醇浓度、液料比以及时间同乙醇浓度之间的和时间同pH值之间的交互项对总黄酮得率有显著影响,超声时间对总黄酮得率无显著影响。经试验验证,当pH值为5.6、乙醇浓度为75%、液料比为26、超声时间为80min时总黄酮得率最高,达(3.314±0.163)%(n=3),与理论计算值3.348%基本一致。回归模型可较好地预测柑桔皮中总黄酮的提取得率。通过硅胶、聚酰胺以及Sephadex HL-20柱对温州蜜桔皮中类黄酮化合物进行反复分离纯化,从中分离出5种类黄酮单体。借助于ESI-MS和1H-NMR 13C-NMR以及红外光谱等技术,对五种单体进行了结构确认。它们分别是：化合物A为3,5,6,7,8,3’,4’-七甲氧基黄酮；化合物B为5,6,7,8,4’-五甲氧基黄酮；化合物C为3-羟基-5,6,7,8,3’,4’-六甲氧基黄酮；化合物D为5,6,7,8,3’,4’-六甲氧基黄酮；化合物E为橙皮苷。其中化合物C在柑橘中是首次报道。通过亚油酸体系、脂质体体系分别对柑橘皮中的5种类黄酮单体抗氧化功能进行了研究,结果表明,柑橘皮类黄酮具有一定的抗亚油酸氧化的能力,化合物D和化合物C表现出很强的抗亚油酸氧化的能力,化合物B的抑制能力次之,和槲皮素的抑制能力基本一致。而化合物E的抑制亚油酸氧化能力最差,仅比芦丁略强；柑橘皮中类黄酮单体对共轭二烯(CD-POV)的抑制能力不同,均表现出一定的浓度依赖关系。抑制能力强弱顺序为化合物D>化合物C>化合物B>≈槲皮素>化合物A>化合物E>芦丁。5种类黄酮单体A、B、C、D、E的半抑制浓度IC50分别为3.11、2.65、0.96、0.35、3.52μg/mL。比较了5个柑橘类黄酮单体对[·OH]自由基的清除效果,清除能力对浓度具有一定的依赖性。以化合物D和化合物C对[·OH]自由基的清除能力较强,IC50分别为3.2 gg/mL和5.6μg/mL,化合物E对[·OH]自由基的清除能力最弱(IC50=13.6 gg/mL)。清除能力由强到弱的顺序为：化合物D>化合物C>化合物B>化合物A>化合物E>芦丁。应用MTT法和PTP1B法进行了5种柑橘类黄酮单体的抗肿瘤和抗糖尿病活性筛选,结果表明仅化合物D和化合物B能有效抑制肿瘤细胞生长,而对蛋白质酪氨酸磷酸酯酶PTP1B无有效的抑制作用。以橙皮苷为原料,经糖苷水解、选择性甲基化、脱氢、脱甲基化、O-异戊烯基化和O-法呢烯基化等反应步骤,分别以总收率60%、39%、64%、16%、15%合成了药用类黄酮天然产物桃皮素、木犀草素和新类黄酮化合物7-O-异戊烯基橙皮素、7-O-法呢烯基橙皮素、7,3’-O,O-二法呢烯基橙皮素,所合成产物通过NMR、IR、MS进行了结构确证。本合成方法原料易得、工艺简便、收率较高,具有较高的实用价值。

全文目录


摘要  4-6
ABSTRACT  6-9
本论文中所使用的缩写词对照表  9-14
1 绪论  14-32
  1.1 柑橘的分布与植物生态学  14-16
    1.1.1 分布区域  14
    1.1.2 植物生态学  14-16
  1.2 柑橘的国内外生产现状  16-17
    1.2.1 中国柑橘生产现状  16-17
    1.2.2 世界柑橘生产现状  17
  1.3 柑橘果皮的研究现状  17-20
    1.3.1 柑橘香精油  18
    1.3.2 柠檬精油  18
    1.3.3 果胶的提取  18-19
    1.3.4 生物活性成分  19
    1.3.5 膳食纤维  19-20
  1.4 柑橘类黄酮  20-30
    1.4.1 柑橘类黄酮生物活性  21-26
    1.4.2 柑橘类黄酮的产业化开发  26-27
    1.4.3 类黄酮化合物的提取  27-29
    1.4.4 类黄酮化合物的分离纯化  29-30
  1.5 本课题的立题背景及研究目的  30-31
  1.6 本论文研究的主要内容  31-32
2 柑橘皮基本化学组成分析  32-47
  2.1 引言  32-33
  2.2 材料与方法  33-36
    2.2.1 材料与设备  33
    2.2.2 方法  33-36
  2.3 结果与讨论  36-45
    2.3.1 柑橘皮中粗蛋白、粗脂肪及挥发油  36
    2.3.2 柑橘皮中蛋白氨基酸组成  36-38
    2.3.3 柑橘皮油脂肪酸组成  38-39
    2.3.4 柑橘皮挥发油化学组成  39-42
    2.3.5 柑橘皮中类黄酮的初步分析结果  42-45
  2.4 本章小结  45-47
3 柑橘皮总黄酮提取工艺优化及其数学模型研究  47-60
  3.1 引言  47
  3.2 材料与方法  47-49
    3.2.1 试验材料  47
    3.2.2 主要试剂及仪器  47-48
    3.2.3 方法  48-49
  3.3 试验设计  49-50
    3.3.1 确定变量变化范围及编码  49-50
    3.3.2 数据分析  50
  3.4 结果分析与讨论  50-58
    3.4.1 回归模型的建立与检验  50-54
    3.4.2 模型的效应分析  54-58
  3.5 本章小结  58-60
4 柑橘皮类黄酮分离、纯化及结构鉴定  60-90
  4.1 引言  60-61
  4.2 材料与方法  61-64
    4.2.1 实验材料与设备  61
    4.2.2 方法  61-64
  4.3 结果与讨论  64-89
    4.3.1 化合物A的结构鉴定  64-69
    4.3.2 化合物B的结构鉴定  69-75
    4.3.3 化合物C的结构鉴定  75-80
    4.3.4 化合物D的结构鉴定  80-85
    4.3.5 化合物E的结构鉴定  85-89
  4.4 本章小结  89-90
5 柑橘皮中类黄酮物质的生物活性研究  90-103
  5.1 引言  90-91
  5.2 材料与方法  91-94
    5.2.1 主要实验材料与设备  91-92
    5.2.2 体外抗氧化活性方法  92-93
    5.2.3 抗肿瘤生物活性体外筛选——MTT法  93-94
    5.2.4 抗糖尿病和肥胖症生物活性体外筛选——PTP1B法  94
    5.2.5 统计学方法  94
  5.3 结果与讨论  94-102
    5.3.1 柑橘皮中类黄酮组分抗氧化活性的研究  94-100
    5.3.2 柑橘皮中黄酮类组分抗肿瘤生物活性研究  100-101
    5.3.3 柑橘皮中黄酮类组分抗糖尿病和肥胖症生物活性研究  101-102
  5.4 本章小结  102-103
6 从橙皮苷半合成5种生物活性类黄酮化合物研究  103-118
  6.1 引言  103-104
  6.2 材料与方法  104-107
    6.2.1 试剂与设备  104-105
    6.2.2 方法  105-107
  6.3 结果与讨论  107-117
    6.3.1 橙皮素的合成  107
    6.3.2 桃皮素的合成  107
    6.3.3 地奥明的合成  107-108
    6.3.4 香叶木素的合成  108
    6.3.5 木犀草素的合成  108
    6.3.6 7-O-异戊烯基橙皮素的合成  108-109
    6.3.7 7-O-法呢烯基橙皮素和7,3’-O,O-二法呢烯基橙皮素的合成  109-110
    6.3.8 讨论  110-117
  6.4 本章小结  117-118
7 结论与展望  118-121
  7.1 结论  118-119
  7.2 展望  119-121
参考文献  121-136
附录A:论文附图  136-141
附录B:攻读博士学位期间的主要学术成果  141-144
致谢  144

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中图分类: > 医药、卫生 > 中国医学 > 中药学 > 中药化学
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