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一株益生乳酸菌的分离鉴定、生物学特性及其对黑鲷肠道、血清的影响

作　者: 章蔚
导　师: 戴贤君
学　校:
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 明串珠菌属乳酸菌 黑鲷幼鱼 肠道菌群 DGGE
分类号: S963
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


乳酸菌是公认安全的微生物，它是一类能利用碳水化合物发酵并产生大量乳酸的细菌。乳酸菌等益生菌可通过加强宿主机体肠道微生物的屏障作用，间接提高宿主非特异性免疫力，从而提高动物的健康水平和抗病力。本试验从黑鲷肠道分离出一株益生乳酸菌并通过生化鉴定和16S rDNA分子鉴定为明串珠菌属乳酸菌（Leuconostoc lactis）。将此株乳酸菌在体外对其生物学特性研究：此乳酸菌对低pH、胆盐、胃蛋白酶、胰蛋白酶均具有较好的耐受性，但是高浓度的胆盐、胃蛋白酶、胰蛋白酶会影响其生存活力。在测试的20种常见抗生素中，对多种抗生素敏感，对少量几种抗生素会产生抗性，如头孢噻吩、头孢曲松、妥布霉素、亚胺培南。此乳酸菌还具有体外自凝集性和共凝集性，在培养20h后，此乳酸菌的自凝集率达23.29%，对7种致病菌：大肠杆菌O157（Escherichia coli O157）、志贺氏菌（Shigella）、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、变形杆菌（Proteusbacillus vulgaris）、单增李斯特菌（Listeriamonocytogenes）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的凝集率分别为10.74%、24.36%、16.49%、24.41%、20.99%、29.44%、31.21%。此外，此乳酸菌还具有广谱抑菌活性，对大肠杆菌（E. coli O157）、鼠伤寒沙门氏菌（S.typhimurium）、变形杆菌（P. vulgaris）、副溶血弧菌（V. parahaemolyticus）、哈维氏弧菌（Vibrio Harveyi）、溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）、芽孢杆菌（Bacillussubtilis）、志贺氏菌（Shigella）、金黄色葡萄球菌（S. aureus）均有不同程度的抑制作用，其中，对大肠杆菌（E. coli O157）、鼠伤寒沙门氏菌（S. typhimurium）、变形杆菌（P. vulgaris）、弧菌（Vibrio）的抑制作用较好。选用50g左右的健康黑鲷幼鱼48尾为试验对象，随机分为空白对照组、溶菌酶对照组和明串珠菌乳酸菌试验组，溶菌酶组和乳酸菌试验组幼鱼按鱼体重的5%饲喂含7200U/g重组溶菌酶的配合饲料和含1×10~7cfu/g乳酸菌的配合饲料，饲喂56天，空白对照组饲喂配合饲料。试验14d、28d、42d、56d屠宰幼鱼取血样、肠道及内容物。测定血清生化指标；制备肠道组织横截面切片，HE染色观察测量肠道形态；采用PCR-DGGE技术分析肠壁、内容物菌群变化。结果表明：根据条带聚类相似性（UPGAMA）分析，试验14d、28d、42d、56d时各泳道肠壁菌群相似性为0.52、0.45、0.66、0.7，肠内容物菌群相似性，0.57、0.61、0.66、0.69。在肠壁的DGGE图谱中，14d、28d、42d和56d乳酸菌组的平均条带数显著（P<0.05）多于空白对照组和溶菌酶组；在内容物的DGGE图谱中，在56d时，乳酸菌组的平均条带数显著（P<0.05）多于对照组和溶菌酶组，说明明串珠菌乳酸菌可增加幼鱼肠道菌群多样性。对空白对照组、溶菌酶组和明串珠菌乳酸菌组的共同优势条带回收测序，发现黑鲷幼鱼肠道的优势菌群主要包括假单胞菌属（Pseudomonas）、肠杆菌属（Enterbacter）、微球菌属（Micrococcus）、微小杆菌属（Exiguobacterium）、不动杆菌属（Acinetobacter）、红杆菌属（Rhodobacter）、枯草芽孢杆菌属（Brevibacterium）。饲喂乳酸菌的黑鲷幼鱼肠道肌层厚度、粘膜厚度、绒毛长度和绒毛宽度随试验时间延长均有增加的趋势，肌层厚度在14d、28d、42d和56d期间，乳酸菌试验组和空白对照组、溶菌酶对照组均无显著差异；粘膜厚度在14d、28d、42d和56d显著（P<0.05）大于空白对照，14d、28d时显著大于溶菌酶组的幼鱼肠道粘膜厚度；绒毛宽度在14d、28d、42d和56d和空白对照组、溶菌酶对照组均无显著差异；绒毛长度在14d、28d、42d和56d显著（P<0.05）大于空白对照组，在14d、28d、42d乳酸菌组绒毛长度显著（P<0.05）大于溶菌酶组；因此，饲喂乳酸菌可以促进黑鲷幼鱼肠道生长。饲喂乳酸菌的黑鲷幼鱼血清葡萄糖含量在56d时显著低于对照组幼鱼（P<0.05）；乳酸菌组的血清蛋白质含量在42d显著（P<0.05）高于空白对照组和溶菌酶组；乳酸菌组的血清SOD活力在56d显著（P<0.05）高于空白对照组，然和溶菌酶组幼鱼14d、28d、42d和56d均无差异；乳酸菌组的血清溶菌酶活力在42d、56d显著（P<0.05）高于空白对照组，42d显著（P<0.05）高于溶菌酶组；抗菌活力在42d、56d显著（P<0.05）高于空白对照组，和溶菌酶组均无显著差异；由此可知，饲喂乳酸菌在一定程度上能对幼鱼血清各指标产生影响

全文目录


致谢  5-6
摘要  6-8
Abstract  8-15
图清单  15-16
表清单  16-17
1 绪论  17-29
  1.1 前言  17
  1.2 鱼肠道菌群  17-20
    1.2.1 鱼类肠道结构  17-18
    1.2.2 鱼类肠道菌群的形成  18
    1.2.3 鱼类肠道菌群结构  18-19
    1.2.4 鱼类肠道菌群数量  19-20
    1.2.5 鱼类肠道菌群分布  20
  1.3 鱼肠道菌群和鱼体的关系  20-21
    1.3.1 营养功能  20
    1.3.2 防御功能  20-21
  1.4 鱼肠道乳酸菌  21-24
    1.4.1 乳酸菌在鱼肠道的分布  22
    1.4.2 影响乳酸菌在鱼肠道分布的因素  22-23
    1.4.3 乳酸菌在鱼肠道的功能作用  23
    1.4.4 乳酸菌在水产中的应用  23-24
  1.5 明串珠菌属乳酸菌  24
  1.6 研究鱼类肠道菌群的技术方法  24-27
    1.6.1 变性梯度凝胶电泳（DGGE）  26-27
    1.6.2 PCR-DGGE 存在的技术缺陷  27
  1.7 结语  27-28
  1.8 本研究的内容和意义  28
  1.9 课题来源及论文内容安排  28-29
2 鱼肠道乳酸菌分离、鉴定  29-33
  2.1 材料  29
    2.1.1 实验材料  29
    2.1.2 实验试剂及配制方法  29
    2.1.3 实验仪器  29
  2.2 方法  29-30
    2.2.1 菌株分离纯化  29-30
    2.2.2 分离株菌落形态特性及生化鉴定  30
    2.2.3 分离株 16S rDNA 鉴定  30
  2.3 结果  30-33
    2.3.1 分离株形态鉴定  30-31
    2.3.2 分离株生理生化鉴定  31
    2.3.3 分离株 16S rDNA 鉴定  31-33
  2.4 讨论  33
3 明串珠菌属乳酸菌生物学特性研究  33-44
  3.1 材料  33-34
    3.1.1 实验材料  33
    3.1.2 实验试剂及配制  33-34
    3.1.3 实验仪器  34
  3.2 方法  34-37
    3.2.1 明串珠菌属乳酸菌对 pH 的耐受试验  34
    3.2.2 明串珠菌属乳酸菌对胆盐的耐受试验  34
    3.2.3 明串珠菌属乳酸菌对胃蛋白酶的耐受试验  34-35
    3.2.4 明串珠菌属乳酸菌对胰蛋白酶的耐受试验  35
    3.2.5 明串珠菌属乳酸菌对抗生素敏感性试验  35
    3.2.6 明串珠菌属乳酸菌凝集试验  35-36
    3.2.7 明串珠菌属乳酸菌抑菌活性试验  36-37
    3.2.8 数据分析  37
  3.3 结果  37-43
    3.3.1 乳酸菌对 pH 耐受  37-38
    3.3.2 乳酸菌对胆盐耐受  38
    3.3.3 乳酸菌对胃蛋白酶耐受  38-39
    3.3.4 乳酸菌对胰蛋白酶耐受  39-40
    3.3.5 乳酸菌对抗生素敏感性  40
    3.3.6 乳酸菌凝集试验  40-42
    3.3.7 乳酸菌抑菌活性  42-43
  3.4 讨论  43-44
4 明串珠菌属乳酸菌对黑鲷肠道菌群结构影响的初步研究  44-59
  4.1 材料  44-46
    4.1.1 实验材料  44-45
    4.1.2 实验试剂及配制  45-46
    4.1.3 实验仪器  46
    4.1.4 引物  46
    4.1.5 动物实验饲料制备  46
  4.2 方法  46-49
    4.2.1 实验鱼饲养方法  46-47
    4.2.2 试验方法  47
    4.2.3 肠道样品采集  47
    4.2.4 肠道内容物细菌和肠壁细菌 DNA 的提取  47
    4.2.5 肠壁和内容物细菌 16S rDNA-V3 区 PCR 扩增  47-48
    4.2.6 细菌 DNA 的 PCR-DGGE 分离  48-49
    4.2.7 割胶回收条带并克隆测序  49
    4.2.8 数据处理  49
  4.3 结果  49-58
    4.3.1 肠壁和内容物细菌 16S rDNA-V3 区（含 GC）PCR 扩增  49-52
    4.3.2 DGGE 图谱分析  52-57
    4.3.3 DGGE 图谱对应的肠道优势条带 DNA 序列分析  57-58
  4.4 讨论  58-59
5 明串珠菌属乳酸菌对黑鲷肠道形态结构的影响  59-64
  5.1 材料  59-60
    5.1.1 实验材料  59
    5.1.2 实验试剂及配制  59-60
    5.1.3 实验仪器  60
  5.2 方法  60-62
    5.2.1 实验黑鲷幼鱼分组  60
    5.2.2 实验鱼饲养、饲喂  60
    5.2.3 肠道样品采集  60
    5.2.4 石蜡切片制作方法  60-61
    5.2.5 切片后 H-E 染色  61
    5.2.6 切片检测指标及观察方法  61
    5.2.7 数据处理  61-62
  5.3 结果  62-63
  5.4 讨论  63-64
6 明串珠菌属乳酸菌对黑鲷血清指标影响  64-69
  6.1 材料  64
    6.1.1 实验材料  64
    6.1.2 实验试剂  64
    6.1.3 实验仪器  64
  6.2 方法  64-66
    6.2.1 实验黑鲷幼鱼分组  64
    6.2.2 实验鱼饲养、饲喂  64-65
    6.2.3 血清样品采集  65
    6.2.4 血清各指标测定  65
    6.2.5 数据处理  65-66
  6.3 结果  66-67
  6.4 讨论  67-69
7 总结  69-71
  7.1 结论  69
  7.2 课题展望  69-71
参考文献  71-77
作者简历  77

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产养殖技术 > 水产动物饵料及其营养
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