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猪溶素诱导宿主产生炎症因子的分子机制研究

作　者: 毕丽丽
导　师: 秦鄂德; 姜永强
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 微生物学
关键词: 猪链球菌2型猪溶素（SLY）炎症因子 TLR4 p38MAPK
分类号: S858.28
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

猪链球菌可以引起猪脑膜炎，是世界公认可引起动物传染病的重要病原体。作为一种人畜共患病病原菌，猪链球菌感染人类的散发病例（主要是脑膜炎）在过去的四十五年已有报道。在2005年，中国报道超过200人感染猪链球菌，病死率高达20%。死亡病例表现为罕见的中毒性休克样综合征（TSLS），而且这类病人血清中细胞因子（IL-1β，IL-6， IL-8， IL-12p70， IFN-γ和TNF-α）水平明显高于临床表现为单纯脑膜炎的病人。这些细胞因子的过量释放可能是引起TSLS的重要原因。众多国外学者发现，欧洲的猪链球菌致病株31533经过热灭活性后，可以激活人类单核细胞系THP-1以及小鼠巨噬细胞系J774A1和P388D1，释放大量的细胞因子。细菌的细胞壁成分及其毒力因子猪溶素（SLY）可以激活内皮细胞释放细胞因子。纯化的重组SLY蛋白可以刺激人单核细胞释放TNF-α，也可以刺激猪PAMs释放IL-6。在中国引起暴发流行的猪链球菌为ST7型，与欧洲流行株ST1型相比，ST7型对人外周血单个核细胞（PBMC）的毒性较强；而且SLY蛋白在我国的ST7型菌株中表达量高于ST1型，是重要的毒力因子。本研究通过毒力基因筛选，发现SLY是中国流行株中引起宿主产生炎症因子的重要毒力蛋白。SLY由497个氨基酸残基组成，归属于依赖胆固醇的细胞溶素（CDC）家族；CDC家族目前具有23个成员，包括产气荚膜梭菌释放的外毒素（PFO）,以及化脓性链球菌释放的外毒素（SLO）。CDC家族所有成员都是由革兰氏阳性菌释放的一种外毒素，他们共同的特征是可以在富含胆固醇的细胞膜上打孔从而引起细胞通透性改变或者导致细胞裂解。据报道，SLY可以在人红细胞表面打孔，形成直径约为7nm的小孔，从而引起红细胞裂解，即我们通常所说的溶血。以2005年分离的中国猪链球菌致病株05ZY为模板，本室构建了多株毒力基因缺失突变株。本研究首先通过构建细胞模型，对缺失突变株进行筛选，实验结果表明野生菌株05ZY可以诱导内皮细胞产生炎症因子，sly基因敲除后，不能诱导内皮细胞产生炎症因子。紧接着，对其编码的蛋白进行纯化和鉴定；深入研究了SLY蛋白诱导细胞产生炎症因子的机制。随后，选用了PBMC、THP-1MΦ、RAW264.7和小鼠腹腔分离的原代巨噬细胞为细胞模型，对SLY的作用进行深入研究。实验结果表明PBMC对SLY蛋白敏感性强于巨噬细胞，具体表现为低浓度的SLY即可诱导PBMC产生高浓度TNF-α。由于细胞碎片也可以诱导细胞产生炎症因子，本研究还构建了重组SLY蛋白（rSLY）以及完全缺失溶血活性的点突变蛋白（P353V），进一步研究SLY的作用是否依赖其溶血活性。实验结果表明SLY的作用不依赖其溶血活性，很可能是被宿主重要模式识别受体识别，从而导致炎症因子的释放。国内外学者通过体内和体外实验，均证明了SLY可以诱导宿主产生炎症因子，但是却没有进一步的深入研究其机制。作者通过文献调研，发现同家族的PLY(肺炎链球菌分泌的外毒素)诱导巨噬细胞产生炎症因子通过TLR4受体发挥作用。SLY是否与PLY有相似的作用值得进一步研究。本研究应用了多种受体抑制剂，结果发现TLR4特异性抑制剂可以完全抑制SLY对多种细胞的作用，推测SLY的作用很可能依赖于TLR4受体。紧接着，本研究引入了TLR4点突变小鼠，结果显示，SLY诱导细胞产生炎症因子依赖于TLR4受体。随后，应用MyD88、TRIF以及MAPKs特异性抑制剂来分析SLY-TLR4的下游信号通路。结果显示，MyD88是SLY发挥作用的重要胞内接头蛋白分子。而p38-MAPK抑制剂可以完全抑制SLY对PBMCs的作用。应用western blot检测技术来分析SLY对细胞MAPKs的直接激活情况，结果表明SLY在短时间内即可直接激活PBMCs细胞内的p38-MAPK分子。最后利用荧光素报告基因检测技术来研究SLY对转录因子的激活作用，结果表明SLY可以激活转录因子NF-κB。NF-κB激活后从胞浆内进入细胞核，从而调控炎症因子的表达。虽然有报道称热灭活的欧洲菌株31533可以激活单核巨噬细胞释放多种炎症因子。但是细菌的浓度必须达到109cfu/ml才可以诱导细胞产生高水平的炎症因子，当细菌浓度降至108cfu/ml时，TNF的水平很快降落下来。TNF是最早被检测的细胞因子，其动力学分析显示，其水平可于5小时内迅速降至基线水平。而国外学者从31533提取的细胞壁成分，浓度高达150ug/ml才可以诱导THP-1MΦ细胞产生TNF-α，本研究应用SLY浓度为100ng/ml时激活THP-1MΦ产生TNF-α水平与其相当。值得一提的是，12.5ng/ml的SLY蛋白即可诱导PBMCs产生大量TNF-α，并且此效应可以持续长达36小时。本研究中所用的细胞模型包括单核巨噬细胞（THP-1MΦ，RAW264.7，小鼠来源的原代腹腔巨噬细胞）和PBMC。结果显示PBMC对SLY的敏感性明显高于巨噬细胞。巨噬细胞主要位于不同组织中，属于人体第一道防线的免疫细胞，此部位发生炎症反应通过炎症因子的释放，可以帮助机体有效清除病原菌，将感染控制在局部。但是，细菌一旦进入血液中将会是致命的，因为mol/L的SLY蛋白短时间内即可诱导PBMC产生大量TNF-α，这种全身性释放TNF-α可以引起休克。而在中国的猪链球菌病人血中可以轻易分离出该菌。所以SLY蛋白与PBMC的相互作用应当引起足够的重视。由于LPS可通过TLR4受体激活免疫细胞，释放炎症因子。因此本研究运用多种手段排除内毒素LPS的影响。第一，基于LPS的热稳定性，作者对天然SLY蛋白进行加热处理，再与细胞共孵育；第二，基于多粘菌素B可以使LPS失去诱导细胞产生炎症因子的作用，作者将蛋白与多粘菌素B在4℃提前作用1小时，再与细胞共孵育；第三，本研究运用Ttritoon X-114抽提去除重组蛋白中的LPS，使内毒素的含量符合国际标准（＜5EU/mg）；最后，应用无关蛋白做对照，无关蛋白是猪链球菌的细胞壁蛋白，其诱导表达纯化与去除LPS过程与rSLY和P353V均一致。经过以上处理后，实验结果均证明，SLY可以诱导细胞产生炎症因子。本研究首次揭示出SLY蛋白诱导细胞产生炎症因子不依赖其溶血活性，并且此作用通过TLR4受体介导。S.suis与宿主相互作用具有双刃剑的作用。S.suis分泌的毒力蛋白SLY具有溶血活性可以对真核细胞造成直接损伤，而SLY诱导细胞产生炎症因子的作用又可以激活机体的免疫反应，从而帮助宿主清除病原菌。但是若S.suis分泌的SLY蛋白激活真核细胞过度释放炎症因子，则宿主容易发生TSLS。SLY蛋白诱导细胞产生炎症因子的细胞受体和胞内信号通路首次被揭示。p38-MAPK特异性抑制剂在不同细胞类型表现迥异，SLY可以直接激活PBMC中p38-MAPK。TLR4和p38-MAPK可以作为预防或治疗中国猪链球菌病的重要靶点。由于SLY诱导细胞产生炎症因子的作用不依赖其溶血活性，因此P353V可以作为保护性抗原进行深入研究。

全文目录

缩略词表  5-8
摘要  8-11
ABSTRACT  11-14
前言  14-16
第一章研究背景与研究现状  16-28
  1 猪链球菌及其毒力因子 SLY 蛋白研究现状  16-21
    1.1 猪链球菌研究现状  16-17
    1.2 SLY 研究现状  17-21
  2.机体的固有免疫与炎症反应  21-28
    2.1 固有免疫中重要模式识别受体  22-23
    2.2 Toll 样受体家族（Toll like receptors,TLRs）  23-25
    2.3 MAPK 信号通路  25-26
    2.4 NF‐κB 等转录因子  26-27
    2.5 炎症反应  27-28
第二章实验材料与实验方法  28-36
  1 实验材料  28-31
    1.1 菌株  28
    1.2 蛋白表达与纯化所用材料  28-29
    1.3 真核细胞及细胞培养相关试  29
    1.4 ELISA 实验相关试剂  29
    1.5 WESTERN BLOT 实验相关试剂  29-30
    1.6 荧光素报告基因实验相关材料  30
    1.7 实验动物  30
    1.8 主要化学试剂与耗材  30-31
    1.9 主要仪器  31
  2 实验方法  31-36
    2.1 天然蛋白的提取纯化与重组蛋白的诱导表达与纯化  31-32
    2.2 ：SLY 蛋白溶血活性测定  32-33
    2.3 ：SLY 蛋白内毒素的去除与测定  33
    2.4 ：细胞培养和转染  33-34
    2.5 ：人外周血单个核细胞（PBMC）分离方法  34
    2.6 ：小鼠腹腔巨噬细胞分离方法  34
    2.7 ：ELISA 检测  34
    2.8 ：WESERN BLOT 检测  34-35
    2.9 ：荧光素报告基因检测  35
    2.10 ：小鼠模型和处理  35
    2.11 ：质粒的提取  35
    2.12 ：免疫共沉淀  35
    2.13 ：统计学分析  35-36
第三章实验结果  36-66
  1 SLY 是猪链球菌中引起宿主细胞炎症反应的主要毒力因子  36
  2 SLY 蛋白的纯化与评价  36-40
  3 nSLY 可以激活多种免疫细胞产生炎症因子  40-42
  4 nSLY 激活免疫细胞释放 TNF‐Α具有量效性和时效性  42-43
  5 nSLY 诱导细胞产生 TNF‐Α不依赖其溶血活性  43-45
  6 nSLY 诱导细胞产生 TNF‐Α通过 TLR4  45-47
  7 MYD88 是 SLY‐TLR4 信号通路的重要接头蛋白  47-48
  8 SLY 可以直接激活人 PBMC 胞内的 P38‐MAPK  48-50
  9 SLY 可以直接激活 RAW264.7 胞内的转录因子 NF‐ΚB  50-51
  10 MD2、CD14 和 LBP 分子可能与 SLY 相互作用从而诱导细胞产生 TNF‐Α  51-53
  11 肝素结合蛋白（HBP）不能协调促进 SLY 诱导细胞产生 TNF‐Α  53
  12 SLY 抗血清不能封闭 SLY 诱导细胞产生 TNF‐Α  53-54
  13 TLR2 和 TLR4 单克隆抗体对 SLY 诱导细胞产生 TNF‐Α的影响  54-55
  14 NSLY 对内皮细胞的激活情况  55-56
  15 NSLY 对原代小鼠腹腔巨噬细胞激活释放 TNF‐Α情况  56-57
  16 NSLY 诱导小鼠原代腹腔巨噬细胞释放 IL‐6 情况  57-58
  17 体内攻毒实验  58-60
  18 体内攻毒后组织切片结果  60-64
  19 猪链球菌 15 种重组蛋白诱导细胞产生炎症因子情况  64-66
讨论  66-68
结论  68-69
参考文献  69-74
撰稿文章  74-92
个人简历  92-93
致谢  93

猪溶素诱导宿主产生炎症因子的分子机制研究

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