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猪β-防御素1基因在大肠杆菌中的表达与活性鉴定

作　者: 苏健
导　师: 徐世文
学　校: 东北农业大学
专　业: 临床兽医学
关键词: 猪β-防御素1 融合表达 抑菌活性 链球菌
分类号: S828
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


防御素(defensins)是生物体在抵御病原微生物的防御过程中产生的一类重要的抗菌肽类物质。它具有十分广泛的抗菌谱,可以抵抗细菌、真菌、被膜病毒等多种微生物。由于其独特的抗菌机制,不会诱发细菌耐药性的产生,已成为具有巨大发展潜力的新型抗菌药物。猪β防御素-1(porcine β-defensin1, pBD-1)是广泛分布于猪消化道、呼吸道、肝和肾等多种组织细胞内的一类活性多肽,在猪防御系统中起重要作用。它同样可被用作食品保鲜剂和饲料添加剂,随着对其研究的深入,可以相信猪防御素将在动物养殖、疾病预防和提高畜产品品质等方面发挥更大作用。本研究的目的就是在克隆猪舌上皮防御素的基础上,利用大肠杆菌表达系统实现pBD-1的高效表达,通过蛋白复性方法,以期获得高产量有活性的防御素产品,为猪防御素的工程化生产及在畜牧养殖业中的应用奠定基础。本实验以健康新鲜猪舌上皮黏膜为实验材料,以GenBank中报道的pBD-1的cDNA序列及载体pET-30a的多克隆位点为基础设计引物,其中上游引物含有BamHI酶切位点,下游引物含有Xhol酶切位点。采用RT-PCR方法扩增出pBD-1基因,将其克隆到pMD18-T载体中进行序列测定。通过BamHI和Xhol限制性内切酶酶切重组质粒pMD18-T-pBD-1获得编码成熟肽pBD-1基因,大小为126bp,然后插入到pET-30a载体的BamHI和Xhol位点,构建重组表达质粒pET-30a-pBD-1;重组表达质粒转化到大肠杆菌Roseetta (DE3)中,经测序鉴定,成功构建pBD-1的融合表达系统。阳性克隆菌经摇瓶发酵和IPTG诱导,菌液破碎后进行Tricine SDS-PAGE分析,融合蛋白纯化,酶切去除His标签,蛋白复性,最后利用琼脂孔穴扩散法检测抑菌活性。结果表明,融合蛋白His-pBD-1以可溶性的形式进行表达,蛋白纯化后经Bradford法测定1L菌液可表达约50mg的融合蛋白；蛋白复性后,His-pBD-1和pBD-1蛋白均表现出对链球菌良好的抑菌活性,可见His标签对pBD-1蛋白的活性没有影响,pBD-1对链球菌的最小抑菌浓度为40±5.2μg/ml。这为进一步的细胞毒性实验、免疫原性检测和抗菌制剂的开发等后续工作奠定了良好的基础。以巴马小猪为对象建立链球菌感染模型,采用定量PCR方法,测定感染后不同时间点猪舌上皮黏膜中pBD-1表达量。结果表明,染菌后3h pBD-1的表达水平显著提高(p<0.001),且在6h达到最高水平,染菌后12h其表达水平恢复正常。链球菌刺激对猪舌上皮黏膜中pBD-1的表达有增量调节作用。

全文目录


摘要  8-9
Abstract  9-11
1 引言  11-19
  1.1 防御素的分类  11-13
  1.2 防御素的生物学功能  13-14
    1.2.1 抗菌作用  13
    1.2.2 抗病毒作用  13
    1.2.3 抗真菌作用  13
    1.2.4 抗寄生虫作用  13-14
    1.2.5 抗癌作用  14
  1.3 防御素的作用机制  14-16
    1.3.1 细胞膜穿孔作用  15
    1.3.2 抑制细胞壁及蛋白质的合成  15
    1.3.3 线粒体损伤作用  15
    1.3.4 对细胞核染色体的影响  15-16
    1.3.5 诱导细胞凋亡  16
  1.4 防御素在口腔上皮免疫中的作用及临床应用  16-17
  1.5 防御素的原核表达  17-18
    1.5.1 原核表达载体的类型  17
    1.5.2 E.coli的融合表达  17-18
  1.6 本研究的目的和意义  18-19
2 材料与方法  19-33
  2.1 试验材料  19-22
    2.1.1 实验动物的来源及处理  19
    2.1.2 菌株与载体  19
    2.1.3 酶和生化试剂  19
    2.1.4 Tricine SDS-PAGE电泳试剂  19-20
    2.1.5 培养基及有关的溶液配制  20-21
    2.1.6 主要仪器及设备  21-22
  2.2 试验方法  22-33
    2.2.1 pBD-1基因的克隆  22-24
    2.2.2 表达菌株的构建  24-25
    2.2.3 蛋白表达与纯化  25-27
    2.2.4 蛋白酶切  27
    2.2.5 重组表达蛋白的Tricine SDS-PAGE分析  27-28
    2.2.6 蛋白浓缩  28
    2.2.7 蛋白复性  28-29
    2.2.8 蛋白的抑菌活性检测  29-31
    2.2.9 链球菌感染对猪舌上皮中pBD-1表达的影响  31-32
    2.2.10 试验数据的统计与分析  32-33
3 结果  33-42
  3.1 PBD-1基因的克隆  33-34
  3.2 表达菌株的构建  34-35
  3.3 HIs-PBD-1融合蛋白的表达与纯化  35-37
  3.4 蛋白复性  37-38
  3.5 HIs-PBD-1和PBD-1蛋白的抑菌活性检测  38-39
  3.6 QPCR对目的基因MRNA水平检测方法的建立  39-40
    3.6.1 总RNA抽提结果的检测  39
    3.6.2 pBD-1和GAPDH基因qPCR方法的鉴定  39-40
  3.7 链球菌感染对猪舌上皮黏膜中PBD-1转录水平影响的检测结果  40-42
4 讨论  42-47
  4.1 表达系统的筛选与构建  42-43
  4.2 融合蛋白HIS-PBD-1的表达与纯化  43-44
    4.2.1 融合蛋白His-pBD-1表达条件的优化  43
    4.2.2 融合蛋白His-pBD-1的纯化与酶切  43-44
  4.3 HIS-PBD-1和PBD-1蛋白的复性  44-45
  4.4 抑菌活性的检测  45
  4.5 链球菌感染对猪舌上皮黏膜中PBD-1表达水平的增量调节作用  45-47
5 结论  47-48
致谢  48-49
参考文献  49-58
附录  58-60
攻读硕士学位期间发表的论文  60

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 家畜 > 猪
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