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4个柑橘杂交组合杂种胚挽救及早期鉴定

作　者: 陈勇
导　师: 陈善春; 何永睿
学　校: 西南大学
专　业: 植物学
关键词: 柑橘育种杂种胚挽救石蜡切片法分子标记辅助选择
分类号: S666
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

杂交育种是目前国内外应用最普遍、最有效的一种育种方法。柑橘与其它果树不同,很多品种具有多胚性,而且如今栽培的很多优良品种都为无核品种,存在一定程度的性器官败育,这使得杂交育种方法在柑橘育种中的应用受到一定限制。采用胚挽救技术可以让杂种胚的发育不受珠心胚的干扰而获得再生植株,但在杂种胚挽救的同时也会不可避免地伴随珠心苗的产生。因此,建立一种高效的杂种胚挽救技术和杂种胚早期快速鉴定方法对减少珠心胚对杂交育种的干扰、提高柑橘杂交育种效率以及缩短育种周期均具有重要意义。本实验配制了4个杂交组合,台湾椪柑(?)×塔罗科血橙(?)、台湾椪柑早×晚锦橙(?)、晚锦橙早×大红袍(?)和晚锦橙早×天草(?)。从授粉后50天开始,采用石蜡切片法定期观察杂种胚的发育进程并及时判断珠心胚入侵胚囊的时间。珠心开始入侵胚囊后定期取下幼胚进行离体培养,并通过微量法提取胚的总DNA,利用分子标记技术对杂种胚进行早期鉴定,然后将杂种胚诱导成植株。经过试验研究取得结果如下：1杂种胚挽救最佳时期授粉50d后,每3天取一次果,纵剖种子在显微镜下观察晚锦橙和台湾椪柑种子胚的发育情况。结果显示,以晚锦橙作母本的杂交材料中,授粉60d可观察到珠孔端有幼胚形成,而以台湾椪柑为母本的材料中,授粉后70d可观察到幼胚形成。自观察到幼胚后的第5d起,每隔5天取种子制作石蜡切片,镜检珠心胚何时开始入侵胚囊。结果发现晚锦橙和台湾椪柑分别在授粉的70d和85d珠心胚开始入侵胚囊。同时自观察到幼胚出现后开始每5天取1次果进行胚培养。结果显示,结果显示,晚锦橙幼胚大小逐渐增大数量逐渐增多,形态上已经开始分化。台湾椪柑幼胚大小开始增大数量增多,形态上开始分化,合子胚呈现衰退。因此,晚锦橙杂种胚挽救的最佳时期为75d,台湾椪柑应在85d之前。2杂种胚挽救将种子胚接种到不同浓度激素配比的MS培养基中培养,以此筛选最适杂种胚挽救的培养基。激素浓度以IAA 0.5mg/L, 1mg/L,6-BA0.25mg/L,0.5mg/L 1mg/L设置正交组合。结果在加入IAA 1mg/L,6-BA0.5mg/L的MS培养基中幼胚生长态势最好,最适宜用于幼胚培养。经过培养共获得晚锦橙×大红袍幼胚564个,晚锦橙×天草幼胚249个,台湾椪柑×晚锦橙幼胚297个,台湾椪柑×塔罗科血橙幼胚6个。3杂种胚鉴定提取杂交亲本材料的总DNA,从20多对柑橘SSR引物中筛选多态性引物。结果显示,晚锦橙×大红袍的杂种胚可用3对SSR引物(SS4、SS8、Cssr53)鉴别；晚锦橙×天草的杂种胚可用2对SSR引物(Cssr51和Cssr53)鉴定；SS2、台湾椪柑×晚锦橙和台湾椪柑×塔罗科血橙的杂种胚均可用6对SSR引物(SS12、SS15、SS16、SS18、Cssr38、Cssr53)鉴定。采用微量提取法提取幼胚的DNA,利用上述多态性的引物进行杂种胚的早期鉴定。结果从晚锦橙×大红袍杂交组合的胚挽救得到的564个胚中鉴定出43个杂种胚；从晚锦橙×天草杂交材料的249个胚挽救材料中鉴定出13个杂种胚；台湾椪柑×晚锦橙和台湾椪柑×塔罗科血橙杂交组合分别获得胚挽救297和6个胚材料,但没有鉴定出杂种胚。

全文目录

摘要  7-9
Abstract  9-12
第一章文献综述  12-26
  1.1 柑橘产业概况  12-13
  1.2 柑橘育种概况  13-19
    1.2.1 芽变育种  13-14
    1.2.2 杂交育种  14-15
    1.2.3 染色体倍性育种  15-16
    1.2.4 辐射育种  16
    1.2.5 生物技术育种  16-19
  1.3 杂种胚挽救技术  19-21
    1.3.1 适宜的离体培养时间  20
    1.3.2 离体培养所用培养基、激素和其他营养元素  20-21
    1.3.3 培养条件  21
  1.4 杂种胚鉴定方法  21-26
    1.4.1 形态鉴别法  21
    1.4.2 化学鉴别法  21-22
    1.4.3 同工酶鉴别法  22-23
    1.4.4 DNA分子标记鉴别法  23-26
第二章引言  26-28
  2.1 研究背景及意义  26-27
  2.2 技术路线  27-28
第三章实验材料与方法  28-34
  3.1 实验材料  28-30
    3.1.1 植物材料  28
    3.1.2 主要仪器  28
    3.1.3 试剂  28
    3.1.4 常用溶液  28-29
    3.1.5 SSR引物序列  29-30
  3.2 实验方法  30-34
    3.2.1 杂交组合配制  30
    3.2.2 解剖镜观察及石蜡切片制作  30-31
    3.2.3 幼胚培养  31-32
    3.2.4 PCR反应体系  32
    3.2.5 微量DNA提取  32
    3.2.6 多态性引物筛选  32-33
    3.2.7 杂种胚鉴定  33-34
第四章结果与分析  34-48
  4.1 幼果统计  34
  4.2 最佳挽救时期  34-36
  4.3 幼胚培养  36-41
  4.4 多态性引物筛选  41-44
  4.5 杂种胚鉴定  44-47
  4.6 杂种苗再生  47-48
第五章讨论  48-50
  5.1 柑橘杂种胚最佳挽救时期探讨  48
  5.2 杂种胚挽救  48-49
  5.3 分子标记早期鉴定杂种胚  49-50
第六章小结  50-52
参考文献  52-56
致谢  56-57
研究成果  57

4个柑橘杂交组合杂种胚挽救及早期鉴定

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