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纽荷尔脐橙中赤霉素受体基因CsGID1的功能分析

作　者: 申世辉
导　师: 伊华林
学　校: 华中农业大学
专　业: 果树学
关键词: CsGID1 转基因技术亚细胞定位实时定量PCR
分类号: S666.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

近年来,赤霉素受体基因GID成为研究的热点,在许多植物中如拟南芥、水稻、杨树、棉花,葡萄等有所研究,但在柑橘上的研究未见报道。为了研究赤霉素受体基因GID在柑橘上的作用,本论文以纽荷尔脐橙中赤霉素受体基因CsGID1为研究对象,采用转基因技术获得转CsGID1基因烟草植株,并利用石蜡切片技术、亚细胞定位技术、CIRAS-2光合仪,实时荧光定量PCR技术从植物细胞组织、光合生理特性、目的基因的表达量等方面对转基因植株和对照植株进行了分析。主要研究结果如下：1.CsGID1基因序列经Blastn分析,发现它与葡萄(AFG17072.1)和拟南芥(XP002874383.1)的GID1核酸序列相似性分别为81%和79%。用Blastx分析,纽荷尔脐橙中赤霉素受体基因GID1与陆地棉的GID1同源性最高。2.本实验以转基因烟草叶片主脉为材料,通过石蜡切片实验,观察比较转基因植株和对照植株,结果显示,转基因CsGID1烟草叶片主脉木质部导管较对照植株多,且排列紧密不整齐。通过将pBI121-CsGID1-GFP转入洋葱表皮细胞中发现,CsGID1与GFP的融合蛋白在细胞核中表达。3.分别用GA3和多效唑处理转基因阳性植株,结果表明GA3处理的转基因植株最高,净光合速率最大,然而叶绿素含量(1.55±0.09mg/g)最少；多效唑处理的转基因植株株高最矮,叶绿素含量(1.71±0.15mg/g)及净光合速率较大。4.利用实时荧光定量PCR对CsGID1基因在烟草的表达进行了分析,结果显示,CsGID1在转基因阳性植株中的表达量最高,其次是GA3处理的转基因植株,然而在多效唑处理的转基因植株中的表达量最低。

全文目录

摘要  7-8
Abstract  8-10
缩略词表  10-11
1 前言  11-21
  1.1 课题提出  11
  1.2 赤霉素的研究进展  11-20
    1.2.1 赤霉素的生物合成途径  11-13
    1.2.2 赤霉素生物合成关键酶  13-14
      1.2.2.1 古巴焦磷酸合酶(CPS)  13
      1.2.2.2 内根-贝壳杉烯合成酶(KS)  13
      1.2.2.3 内根-贝壳杉烯氧化酶(KAO)  13-14
      1.2.2.4 GA20-氧化酶  14
    1.2.3 赤霉素的信号传导途径研究  14-16
      1.2.3.1 GA反应突变体  14
      1.2.3.2 GA信号传导中的主要成分  14-16
        1.2.3.2.1 正向作用因子  14-15
        1.2.3.2.2 反向作用因子  15-16
    1.2.4 GA信号传导模式  16-17
    1.2.5 赤霉素受体  17-19
      1.2.5.1 赤霉素受体基因GID1的发现  17
      1.2.5.2 赤霉素受体基因GID1  17-19
        1.2.5.2.1 赤霉素受体基因GID1的研究  17
        1.2.5.2.2 GID1蛋白  17-18
        1.2.5.2.3 GID1识别GA的结构基础  18-19
    1.2.6 DELLA蛋白  19
    1.2.7 霉素受体基因GID1与DELLA蛋白的互作  19-20
  1.3 本研究目的和内容  20-21
2 材料与方法  21-35
  2.1 材料  21
    2.1.1 植物材料  21
    2.1.2 菌种与质粒  21
    2.1.3 引物  21
  2.2 主要试剂  21-24
    2.2.1 各种酶类  21
    2.2.2 各种试剂盒  21
    2.2.3 抗生素  21-22
    2.2.4 质粒提取试剂  22
    2.2.5 DNA提取试剂  22
    2.2.6 RNA提取试剂  22
    2.2.7 反转录试剂  22-23
    2.2.8 培养基  23-24
      2.2.8.1 LB培养基  23
      2.2.8.2 YEB培养基  23
      2.2.8.3 MS培养基  23
      2.2.8.4 其他  23-24
  2.3 主要分析仪器设备  24
  2.4 实验方法  24-26
    2.4.1 烟草农杆菌的转化,培养  24-25
    2.4.2 转基因烟草DNA提取  25
    2.4.3 转基因植株的PCR鉴定  25-26
      2.4.3.1 nptⅡ基因PCR鉴定  25-26
      2.4.3.2 目的基因CsGID1 PCR鉴定  26
  2.5 目的基因CsGID1的转化  26-28
    2.5.1 目的基因CsGID1质粒提取  26-27
    2.5.2 胶回收  27
    2.5.3 大肠杆菌转化  27
    2.5.4 农杆菌转化  27-28
  2.6 CsGID1基因的亚细胞定位  28-30
    2.6.1 CsGID1与GFP融合蛋白表达载体的构建  28-30
    2.6.2 农杆菌介导的洋葱表皮细胞的转化和观察  30
      2.6.2.1 农杆菌的转化和筛选  30
      2.6.2.2 洋葱表皮细胞的浸染与共培养  30
  2.7 定量PCR分析赤霉素受体基因CsGID1的表达  30-32
    2.7.1 RNA提取  30-31
    2.7.2 RNA纯化  31
    2.7.3 cDNA的合成及引物特异性检测  31-32
    2.7.4 定量PCR  32
  2.8 转基因植株与对照植株叶片主脉导管观察  32-33
  2.9 植株生理指标的测定  33-35
    2.9.1 植株各项生理指标的测定  33
    2.9.2 激素处理  33-34
    2.9.3 转基因植株叶绿素含量的测定  34
    2.9.4 净光合速率测定  34-35
3 结果与分析  35-43
  3.1 CsGID1序列分析  35
  3.2 CsGID1基因的亚细胞定位分析  35-36
  3.3 转基因植株的分子鉴定  36
    3.3.1 载体pMV-CsGID1的转基因植株nptⅡ的PCR检测  36
    3.3.2 载体pMV-CsGID1的转基因植株中CsGID1基因的PCR检测  36
  3.4 转基因植株木质素导管观察  36-37
  3.5 植株的形态检测  37-40
    3.5.1 植株株高,叶长,节间直径的测量  37-38
    3.5.2 不同激素处理下植株的生长状况  38-39
    3.5.3 转基因植株的光合特性分析  39-40
      3.5.3.1 不同处理株系叶绿素含量的测定  39
      3.5.3.2 不同处理株系光合速率的测定  39-40
  3.6 CsGID1基因的表达分析  40-43
    3.6.1 RNA质量的检测  40
    3.6.2 焚光定量PCR引物特异性检测  40-41
    3.6.3 目的基因CsGID1表达分析  41-43
4 讨论  43-45
  4.1 CsGID1对植株形态影响的分析  43
  4.2 CsGID1的表达分析  43-45
参考文献  45-51
附录  51-53
致谢  53

纽荷尔脐橙中赤霉素受体基因CsGID1的功能分析

内容摘要

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